عدوي فيروس نقص المناعة المزمنة والحاده والمعاد تنشيطها في نماذج الماوس المناعية الانسانيه
Summary
وفيما يلي ثلاثه نهج تجريبية لدراسة ديناميات الاصابه بفيروس نقص المناعة التي تصيب الفئران الانسانيه. ويسمح الأول بدراسة احداث العدوى المزمنة ، في حين يسمح الأخيران بدراسة الاحداث الحاده بعد العدوى الاوليه أو أعاده التنشيط الفيروسي.
Abstract
أنسنه إيماءه/SCID/آيل-2 مستقبلات γ-سلسله الفئرانفارغه تلخيص بعض ملامح المناعة البشرية ، والتي يمكن استغلالها في البحوث الاساسيه وما قبل السريرية علي الامراض المعدية. وصفت هنا ثلاثه نماذج من الفئران المناعية الانسانيه لدراسة ديناميات العدوى بفيروس نقص المناعة التي. ويستند الأول علي حقن داخل الكبد منCD34 + الخلايا الجذعية للدم في الفئران حديثي الولادة ، والذي يسمح لأعاده تشكيل العديد من الدم والخلايا اللمفاوية الانسجه المحصورة ، تليها العدوى مع سلاله الفيروس المرجعي. هذا النموذج يسمح رصد لمده تصل إلى 36 أسابيع بعد العدوى ، التالي يسمي النموذج المزمن. ويشار إلى النموذجين الثاني والثالث باسم النماذج الحاده وأعاده التنشيط ، حيث يتم حقن الخلايا أحاديه النواة في الدم المحيطيه داخل الفئران البالغة. وفي النموذج الحاد ، يتم تطويق الخلايا من متبرع صحي من خلال الطريق داخل الصفاق ، تليها العدوى بسلاله الفيروس المرجعية. وأخيرا ، في نموذج أعاده التنشيط ، يتم التعاطي مع خلايا من متبرع مصاب بفيروس نقص المناعة التي تخضع للعلاج المضاد للفيروسات الرجعية عبر الطريق داخل الصفاق. في هذه الحالة ، بيئة خاليه من المخدرات في الماوس يسمح لأعاده تنشيط الفيروس وزيادة في الحمل الفيروسي. وتصف البروتوكولات المقدمة هنا النهج التجريبي التقليدي لنماذج الماوس الانسانيه وغير المناعية للاصابه بفيروس نقص المناعة الفيروس.
Introduction
وتستند هذه الفئران علي السكري غير البدناء (إيماءه) الخلفية ، مع طفرة scid والطفرة المستهدفة في مستقبل il-2 γ-سلسله الموضع (المشتركة γ سلسله ل il-2 ، آيل-4 ، آيل-7 ، آيل-9 ، آيل-15 ، وآيل-21) ، التي تحفز علي ضعف شديد في تطوير الماوس T-، B-، والطبيعية القاتل (NK) الخلايا1. التالي ، فانها تدعم الانسجه البشرية ، والCD34 البشرية + الخلايا الجذعية التي تكون الدم (hscs) ، والإنسان الطرفية خلايا أحاديه النوى (pbmcs)3،4،5. الاضافه إلى ذلك ، فان التعبير المعدل وراثيا لعوامل الدم البشرية ، مثل عامل الخلايا الجذعية ، والحبيبية/الضامة-عامل تحفيز المستعمرات (GM-السائل الدماغي الشوكي) ، و IL-3 يعزز التطعيم من السكان النخاعي البشري6،7،8.
بالنسبة للدراسات المتعلقة بفيروس نقص المناعة البشرية ، تم وصف عده نماذج من الماوس γ-سلسلهفارغه ، والتي تختلف في سلاله الماوس ، ونوع من خلايا الإنسان المستخدمة ، ونوع من الانسجه للانغراف ، واصل الخلايا (اي ، صحية مقابل. المتبرع المصاب بالفيروس)9،10. سلاله الأصلي ، ومع ذلك ، يستخدم علي نطاق واسع نظرا للمستويات العالية من الخلايا البشرية النسخ المتماثل والفيروسية بعد العدوى مع سلاله الفيروس المرجعي11،12،13. سلالات الماوس المناعية مماثله مع التعبير المحورة وراثيا من العوامل التي تكون الدم الإنسان (علي سبيل المثال ، شراب-exl أو SGM3) أو مع يزرع من الكبد البشري وانسجه الغدة الصعتريه (الفئران نخاع العظم-الكبد-الغدة الصعتريه) مفيده لتقييم دور السكان النخاعي في الاستجابة المناعية المضادة للفيروس ، والآثار المترتبة علي الفيروس علي هذه الانسجه ، ومشاركتها كخزانات الفيروسية14،15. وعلاوة علي ذلك ، يمكن استخدام بعض السلالات مع التعبير المحور وراثيا من جزيئات الكريات البيضاء البشرية (هلا) ، فضلا عن الفئران ، لدراسة استجابه الخلايا التائية للعدوى بفيروس نقص المناعة16،17.
بشكل عام ، في هذه الفئران ، والانسنه يعتمد علي الأصل الخلوية ، والطريق التسليم (داخل الكبد ، في الوريد ، الحقن الوريدي ، اينترارداك) والفار العمر في وقت اينغراتمال18،19،20. وفيما يتعلق أصل الخلية ، CD34الإنسان + HSC المستمدة من دم الحبل الشوكي ، كبد الجنين ، أو الدم الطرفية المعباه يمكن حقنها في حديثي الولادة أو الفئران الشباب3،21. الاضافه إلى ذلك ، الكبار γ-سلسله الفئرانالفارغة يمكن أنسنه بواسطة حقن pbmc (هنا ، يشار اليه باسم الفئرانالخالية من السلسلة γ-pbl-NS) ، مما يسمح للدوران الزمني لهذه الخلايا في الدم ، والاجهزه اللمفاوية الثانوية ، والانسجه الملتهبة22،23،24.
وصفت هنا هو بروتوكول مفصل لإنشاء huNS γ سلسلهخاليه من نماذج الماوس لدراسة العدوى بفيروس نقص المناعة الذاتي. الأول هو النموذج المزمن ، حيث يتم حقن الإنسانCD34 + hscs المستمدة من دم الحبل الشوكي من متبرع صحي في الفئران حديثي الولادة ، تليها العدوى مع سلاله الفيروس المرجعي بعد 14 أسبوعا من أعاده تشكيل جهاز المناعة البشرية. هذا النموذج يسمح رصد الفئران لمده تصل إلى ~ 36 أسابيع بعد العدوى. النموذج الثاني هو نموذج حاد ، والتي يتم حقن Pbmmms من متبرع صحي في الكبار NS γ-سلسله الفئرانفارغه ، تليها العدوى مع سلاله فيروس نقص المناعة البشرية المرجعية بعد 3 أسابيع من الإنسان T-خليه التوسع في الماوس. وأخيرا ، فان النموذج الثالث هو نموذج أعاده التنشيط ، الذي يستمد منه المانحون المصابون بفيروس نقص المناعة المكتسب في اطار العلاج المضاد للفيروسات العكوسه (ART) في الفئران البالغة الγهالخالية من الإيدز. في هذه الحالة ، بيئة خاليه من المخدرات يسمح لأعاده تنشيط الفيروسية وزيادة في الحمل الفيروسي. النموذجين الأخير تسمح الرصد لمده تصل إلى ~ 9 أسابيع بعد العملية.
عموما ، هذه النماذج الثلاثة هي مفيده للدراسات الفيروسية ، والدراسات قبل السريرية من الادويه الجديدة ، وتقييم اثار العدوى بفيروس نقص المناعة الذاتي علي الاستجابة المناعية العالمية. ومن المهم أيضا النظر في ان استخدام الفئران الانسانيه المصابة بفيروس نقص المناعة الذاتية يتطلب مراجعه وموافقه من قبل لجنه السلامة المؤسسية للسلامة البيولوجية وكذلك من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الماشية (IACUC) قبل اي تجربه. وهذا يضمن ان تتبع الدراسة جميع الانظمه المؤسسية الداخلية والخارجية لاستخدام المواد البيولوجية الخطرة والمناولة الانسانيه للحيوانات التجريبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد تم تحقيق تقدم هام في تطوير سلالات الماوس نقص المناعة لأنسنه ، مع عدد من الخيارات المختلفة التي يمكن استخدامها وفقا للاهتمام البحوث1. المنصوص عليها هنا هو بروتوكول عام لإضفاء الطابع الإنساني علي NS γ-سلسلهخاليه من الفئران وسلالات مماثله وراثيا لاستخدامها في ثلاثه نما…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل من قبل القسم السريري IHV الصناديق الداخلية إلى JCZ.
Materials
| 0. 5 ml Microcentrifuge tubes | Neptune | 3735.S.X | |
| 1. 5 ml Microcentrifuge tubes | Neptune | 3745.S.X | |
| 10 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0010 | |
| 15 ml conical tubes | Stellar scientific | T15-600 | |
| 25 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0025 | |
| 5 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0005 | |
| 50 ml conical tubes | Stellar scientific | T50-600 | |
| ACK lysis buffer | Quality biological | 118-156-101 | |
| Alcohol prep pads | Fisher scientific | 06-669-62 | Sterile |
| Anti-Human CD3 clone UCHT1 | Biolegend | 300439 | APC conjugated |
| Anti-Human CD4 clone OKT4 | Biolegend | 317420 | AF488 conjugated |
| Anti-Human CD45 clone 2D1 | Biolegend | 368522 | BV421 conjugated |
| Anti-Human CD8 clone SK1 | Biolegend | 344710 | PerCP-Cy5.5 conjugated |
| Biosafaty cabinet level 2 | If posible connected to an exauste chimeny when handling Isoflurane | ||
| Bonnet | Fisher scientific | 17-100-900 | Single use cap for basic protection |
| Cavicide | Metrex | 13-1000 | Surface desinfectant |
| CD34+ cells | Lonza | 2C-101 | As many vials available from a single donor |
| Centrifuge | Beckman | 65-6KR | |
| Clear jar | Amazon | 77977 | |
| Cotton gauze pad | Fisher scientific | 22-415-468 | Sterile |
| Disposable lab coats | Fisher scientific | 19-472-422 | |
| EDTA micro tubes | Greiner bio-one | 450480 | |
| Face Mask | Fisher scientific | 17-100-897 | |
| FACS lysing solution | BD | 340202 | |
| FBS premium HI | Atlanta biologicals | S1115OH | |
| Ficoll | GE health one | 17-1440-02 | |
| Flow cytometer | We used FACS Aria II | ||
| Flow cytometry tubes | Falcon | 352054 | 5 ml polystyrene and round bottom |
| HIV BaL | Prepared in our uQUANT core facility | ||
| Human PBMCs | HIV positive and negative volunteers | ||
| Infrared warming pad | Venet scientific | DCT-25 | Temporary therapeutic warming pad for small animals |
| Isentress (Raltegravir) | Merck | NSC 0006-0227061 | Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Integrase inhibitor |
| Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Mark I irradiator | Equipment belonging to university of Maryland | ||
| Micro pipettes | |||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Mouse ear tags | National Band & Tag company | 1005-1L1 | |
| Natelson blood collection tubes | Fisher scientific | 02-668-10 | |
| NOG-EXL | Taconic | HSCFTL-13395-F | |
| NSG mice | Jackson | 5557 | Time pregnant females for CD34 engraftment and Juveniles for PBMCs engraftment |
| NSG-SGM3 | Jackson | 13062 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron microscopy sciences | 15710 | |
| PBS 1X pH 7.4 | Gibco | 100-10-023 | |
| Petri dishes | Fisher scientific | 08-757-28 | |
| Quantistudio qPCR machine | Thermo | QS3 | |
| Reagent reservoirs | Costar | 4870 | |
| RPMI media 1640 1X | Gibco | 11875-093 | |
| Shoe covers | Fisher scientific | 17-100-911 | |
| Sterile disposable Gloves | Microflex | SUF-524 | |
| SuperScript II First-Strand Synthesis SuperMix | Invitrogen | 10080-400 | cDNA synthesis |
| Syringes 28-G x 1/2 | BD | 329-461 | |
| Syringes 29-G x 1/2 | BD | 324-702 | |
| Truvada (Emtricitabine and Tenofovir | Gilead | NDC 61958-0701-1 | Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Nicleoside analog-transcriptase inhibitor |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | Cell count and viability |
| Vick Vaporub | School health | 43214 | Ointment based on menthol and eucalyptus |
| Water molecular biology grade | Quality biological | 351-029-131 |
References
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7, 118-130 (2007).
- Koboziev, I., et al. Use of humanized mice to study the pathogenesis of autoimmune and inflammatory diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (7), 1652-1673 (2015).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/γcnull mouse: An excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
- Kim, K. C., et al. A Simple Mouse Model for the Study of Human Immunodeficiency Virus. AIDS research and human retroviruses. 32 (2), 194-202 (2016).
- Wunderlich, M., et al. AML xenograft efficiency is significantly improved in NOD/SCID-IL2RG mice constitutively expressing human SCF, GM-CSF and IL-3. Leukemia. 24 (10), 1785-1788 (2010).
- Billerbeck, E., et al. Development of human CD4+FoxP3+ regulatory T cells in human stem cell factor-, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-, and interleukin-3-expressing NOD-SCID IL2Rγnull humanized mice. Blood. 117 (11), 3076-3086 (2011).
- Coughlan, A. M., et al. Myeloid Engraftment in Humanized Mice: Impact of Granulocyte-Colony Stimulating Factor Treatment and Transgenic Mouse Strain. Stem cells and development. 25 (7), 530-541 (2016).
- Kumar, P., et al. T Cell-Specific siRNA Delivery Suppresses HIV-1 Infection in Humanized Mice. Cell. 134 (4), 577-586 (2008).
- Victor Garcia, J. Humanized mice for HIV and AIDS research. Current Opinion in Virology. 19, 56-64 (2016).
- Araínga, M., Su, H., Poluektova, L. Y., Gorantla, S., Gendelman, H. E. HIV-1 cellular and tissue replication patterns in infected humanized mice. Scientific Reports. 6, 1-12 (2016).
- Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational ART. Journal of Virology. 92 (7), 2118 (2018).
- Medina-Moreno, S., et al. Targeting of CDK9 with indirubin 3’-monoxime safely and durably reduces HIV viremia in chronically infected humanized mice. PLoS ONE. 12 (8), 1-13 (2017).
- Honeycutt, J. B., et al. Macrophages sustain HIV replication in vivo independently of T cells. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1353-1366 (2016).
- Perdomo-Celis, F., Medina-Moreno, S., Davis, H., Bryant, J., Zapata, J. C. HIV Replication in Humanized IL-3/GM-CSF-Transgenic NOG Mice. Pathogens. 8 (33), 1-16 (2019).
- Akkina, R., et al. Improvements and Limitations of Humanized Mouse Models for HIV Research: NIH/NIAID “Meet the Experts” 2015 Workshop Summary. AIDS Research and Human Retroviruses. 32 (2), 109-119 (2015).
- Dudek, T. E., Allen, T. M. HIV-Specific CD8+ T-Cell Immunity in Humanized Bone Marrow-Liver-Thymus Mice. The Journal of Infectious Diseases. 208, 150-154 (2013).
- Skelton, J. K., Ortega-Prieto, A. M., Dorner, M. A Hitchhiker’s guide to humanized mice: new pathways to studying viral infections. Immunology. 154, 50-61 (2018).
- Pearson, T., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Creation of “humanized” mice to study human immunity. Current Protocols in Immunology. , (2008).
- Hasgur, S., Aryee, K. E., Shultz, L. D., Greiner, D. L., Brehm, M. A. Generation of Immunodeficient Mice Bearing Human Immune Systems by the Engraftment of Hematopoietic Stem Cells. Methods in molecular biology. 1438, 67-78 (2016).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- King, M., et al. A new Hu-PBL model for the study of human islet alloreactivity based on NOD-scid mice bearing a targeted mutation in the IL-2 receptor gamma chain gene. Clinical Immunology. 126 (3), 303-314 (2008).
- King, M. A., et al. Human peripheral blood leucocyte non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency interleukin-2 receptor gamma chain gene mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host major histocompatibility complex. Clinical and Experimental Immunology. 157 (1), 104-118 (2009).
- Covassin, L., et al. Human peripheral blood CD4 T cell-engrafted non-obese diabetic-scid IL2rgamma(null) H2-Ab1 (tm1Gru) Tg (human leucocyte antigen D-related 4) mice: a mouse model of human allogeneic graft-versus-host disease. Clinical and experimental immunology. 166 (2), 269-280 (2011).
- Heredia, A., et al. Targeting of mTOR catalytic site inhibits multiple steps of the HIV-1 lifecycle and suppresses HIV-1 viremia in humanized mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9412-9417 (2015).
- Nair, A., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
- Miller, P. H., et al. Analysis of parameters that affect human hematopoietic cell outputs in mutant c-kit-immunodeficient mice. Experimental Hematology. 48, 41-49 (2017).
- Murphy, W. J., et al. Induction of T cell differentiation and lymphomagenesis in the thymus of mice with severe combined immune deficiency (SCID). Journal of Immunology. 153 (3), 1004-1014 (1994).
- Poluektova, L. Y., et al. Humanized Mice as Models for Human Disease. Humanized Mice for HIV Research. , 15-24 (2015).
- Nakata, H., et al. Potent anti-R5 human immunodeficiency virus type 1 effects of a CCR5 antagonist, AK602/ONO4128/GW873140, in a novel human peripheral blood mononuclear cell nonobese diabetic-SCID, interleukin-2 receptor gamma-chain-knocked-out AIDS mouse model. Journal of Virology. 79 (4), 2087-2096 (2005).
- Terahara, K., et al. Fluorescent Reporter Signals, EGFP, and DsRed, Encoded in HIV-1 Facilitate the Detection of Productively Infected Cells and Cell-Associated Viral Replication Levels. Frontiers in Microbiology. 2, 280 (2012).
- Nicolini, F. E., Cashman, J. D., Hogge, D. E., Humphries, R. K., Eaves, C. J. NOD/SCID mice engineered to express human IL-3, GM-CSF and Steel factor constitutively mobilize engrafted human progenitors and compromise human stem cell regeneration. Leukemia. 18 (2), 341-347 (2004).
- Cyster, J. G., et al. Follicular stromal cells and lymphocyte homing to follicles. Immunological Reviews. 176, 181-193 (2000).
- Seung, E., Tager, A. M. Humoral Immunity in Humanized Mice: A Work in Progress. Journal of Infectious Diseases. 208, 155-159 (2013).
- Wahl, A., Victor Garcia, J. The use of BLT humanized mice to investigate the immune reconstitution of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 410, 28-33 (2014).
- Suzuki, M., et al. Induction of human humoral immune responses in a novel HLA-DR-expressing transgenic NOD/Shi-scid/γc null mouse. International Immunology. 24 (4), 243-252 (2012).
- Ali, N., et al. Xenogeneic Graft-versus-Host-Disease in NOD-scid IL-2Rγnull Mice Display a T-Effector Memory Phenotype. PLoS ONE. 7 (8), 1-10 (2012).
- Brehm, M. A., Wiles, M. V., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Generation of improved humanized mouse models for human infectious diseases. Journal of Immunological Methods. 410, 3-17 (2014).
- Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. HIV latency: experimental systems and molecular models. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).
- Wu, F., et al. TRIM5α Restriction Affects Clinical Outcome and Disease Progression in Simian Immunodeficiency Virus-Infected Rhesus Macaques. Journal of Virology. 89 (4), 2233 (2015).
