Infection chronique, aigue et réactivée du VIH dans des modèles de souris immunodéficientes humanisés
Summary
On décrit ici trois approches expérimentales pour étudier la dynamique de l’infection par le VIH chez les souris humanisées. Le premier permet l’étude des événements d’infection chronique, tandis que les deux derniers permettent l’étude des événements aigus après l’infection primaire ou la réactivation virale.
Abstract
Les sourisnulles humanisées de NOD/SCID/IL-2 de récepteur de chaîne de NOD/SCID/IL-2 récapitulent certaines caractéristiques de l’immunité humaine, qui peuvent être exploitées dans la recherche fondamentale et préclinique sur des maladies infectieuses. Décrit ici sont trois modèles de souris immunodéficientes humanisées pour étudier la dynamique de l’infection par le VIH. La première est basée sur l’injection intrahépatique de cellules souches hématopoïétiques CD34chez les souris nouveau-nées, ce qui permet la reconstitution de plusieurs cellules confinées dans le sang et les lymphoïdes, suivies d’une infection par une souche de référence du VIH. Ce modèle permet de surveiller jusqu’à 36 semaines après l’infection et est donc appelé le modèle chronique. Les deuxième et troisième modèles sont appelés modèles aigus et de réactivation, dans lesquels les cellules mononucléaires périphériques de sang sont injectées par voie intrapéritone chez les souris adultes. Dans le modèle aigu, les cellules d’un donneur sain sont greffées par la voie intrapéritonéale, suivies d’une infection par une souche de référence du VIH. Enfin, dans le modèle de réactivation, les cellules d’un donneur infecté par le VIH sous traitement antirétroviral sont greffées par voie intrapéritonéale. Dans ce cas, un environnement sans drogue chez la souris permet la réactivation du virus et une augmentation de la charge virale. Les protocoles fournis ici décrivent l’approche expérimentale conventionnelle pour les modèles humains et immunodéficients de souris de l’infection par le VIH.
Introduction
Le modèle humanisé de souris NOD/SCID/interleukin (IL)-2 récepteur (ci-après appelé huNS -chaînenulle)modèle de souris a été largement utilisé pour étudier la pathogénie des infections, l’auto-immunité, et le cancer, ainsi que pour les études précliniques des médicaments et des thérapies à base de cellules humaines1,2. Ces souris sont basées sur un fond diabétique non-obèse (NOD), avec la mutation cid et la mutation ciblée au locus de chaîne de récepteur d’IL-2 (chaîne commune pour IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, et IL-21), qui induisent une altération grave dans le développement des cellules de t-, b-, et de tueur naturel (NK) de souris1. Ainsi, ils soutiennent l’engraftment des tissus humains, des cellules souches hématopoïétiques (HSC) humaines CD34 et humaines, et des cellules mononucléaires sanguines périphériques humaines (PBMC)3,4,5. En outre, l’expression transgénique des facteurs hématopoïétiques humains, tels que le facteur de cellules souches (SCF), le facteur de stimulation de colonie de granulocyte/macrophage (GM-CSF), et IL-3 favorise l’engraftment des populations myéloïdes humaines6,7,8.
Pour les études sur le VIH, plusieurs modèles de sourisnulles à chaîne huNS ont été décrits, qui diffèrent dans la souche de souris, le type de cellules humaines utilisées, le type de tissus pour l’engraftment, et l’origine des cellules (c.-à-d., sain vs. donneur infecté par le VIH)9,10. La souche originale, cependant, est largement utilisée en raison des niveaux élevés de greffe de cellules humaines et de réplication virale après l’infection avec une souche de référence du VIH11,12,13. Souches de souris immunodéficientes similaires avec expression transgénique de facteurs hématopoïétiques humains (p. ex., NOG-EXL ou NSG-SGM3) ou avec des implants de foie humain et de tissus thymus (souris de moelle-foie-thymus [BLT]) sont utiles pour évaluer le rôle des populations myéloïdes dans la réponse immunitaire anti-VIH, les effets du VIH sur ces tissus, et leur participation en tant que réservoirs viraux14,15. En outre, certaines souches avec l’expression transgénique des molécules humaines d’antigène de leucocyte (HLA), aussi bien que des souris de BLT, peuvent être employées pour étudier la réponse de T-cell à l’infection de HIV16,17.
En général, chez ces souris, l’humanisation dépend de l’origine cellulaire, de la voie d’accouchement (intrapéritonéal, intrahépatique, intraveineuse, intracardiaque) et de l’âge de la souris au moment de l’engraftment18,19,20. En ce qui concerne l’origine cellulaire, l’homme CD34– HSC dérivé du sang de cordon, du foie foetal, ou du sang périphérique mobilisé peut être injecté chez les souris nouveau-nées ou jeunes3,21. En outre, les sourisnulles adultes en chaîne de chaîne peuvent être humanisées par l’injection de PBMC (ici, appelée sourisnulles de la chaîne hu-PBL-NS), permettant la circulation temporelle de ces cellules dans le sang, les organes lymphoïdes secondaires et les tissus enflammés22,23,24.
Décrit ici est un protocole détaillé pour l’établissement de huNS -chaîne des modèles de sourisnulles pour l’étude de l’infection par le VIH. Le premier est le modèle chronique, dans lequel les CD34humains et les HSC dérivés du sang de cordon ombilical d’un donneur sain sont injectés chez des souris nouveau-nées, suivis d’une infection par une souche de référence du VIH après 14 semaines de reconstitution du système immunitaire humain. Ce modèle permet de surveiller les souris jusqu’à 36 semaines après l’infection. Le deuxième modèle est un modèle aigu, dans lequel les PBMC dérivés d’un donneur sain sont injectés chez des sourisnulles adultes de la chaîne NS, suivies d’une infection par une souche de référence du VIH après 3 semaines d’expansion des lymphocytes T humains chez la souris. Enfin, le troisième modèle est le modèle de réactivation, dans lequel les PBMC dérivés d’un donneur infecté par le VIH sous traitement antirétroviral suppressif (TAR) sont injectés chez des sourisadultes à chaîne NS. Dans ce cas, un environnement sans drogue permet la réactivation virale et l’augmentation de la charge virale. Les deux derniers modèles permettent une surveillance jusqu’à 9 semaines après l’engraftment.
Dans l’ensemble, ces trois modèles sont utiles pour les études virologiques, les études précliniques de nouveaux médicaments et l’évaluation des effets de l’infection par le VIH sur la réponse immunitaire mondiale. Il est également important de considérer que l’utilisation de souris infectées par le VIH doit être examinée et approuvée par le Comité institutionnel de biosécurité (BAC) ainsi que par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) avant toute expérience. Cela garantit que l’étude suit toutes les réglementations institutionnelles internes et externes pour l’utilisation de matières biologiques dangereuses et la manipulation humaine d’animaux expérimentaux.
Protocol
Representative Results
Discussion
D’importants progrès ont été réalisés dans le développement de souches de souris immunodéficientes pour l’humanisation, avec un certain nombre d’options différentes qui peuvent être utilisées selon l’intérêt de la recherche1. Fourni ici est un protocole général pour l’humanisation des sourisnulles n.-chaîne NS et souches génétiquement similaires à employer dans trois modèles différents pour étudier l’infection par le VIH. Dans la première approche expérimentale, l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des fonds internes de la division clinique IHV à JCZ.
Materials
| 0. 5 ml Microcentrifuge tubes | Neptune | 3735.S.X | |
| 1. 5 ml Microcentrifuge tubes | Neptune | 3745.S.X | |
| 10 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0010 | |
| 15 ml conical tubes | Stellar scientific | T15-600 | |
| 25 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0025 | |
| 5 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0005 | |
| 50 ml conical tubes | Stellar scientific | T50-600 | |
| ACK lysis buffer | Quality biological | 118-156-101 | |
| Alcohol prep pads | Fisher scientific | 06-669-62 | Sterile |
| Anti-Human CD3 clone UCHT1 | Biolegend | 300439 | APC conjugated |
| Anti-Human CD4 clone OKT4 | Biolegend | 317420 | AF488 conjugated |
| Anti-Human CD45 clone 2D1 | Biolegend | 368522 | BV421 conjugated |
| Anti-Human CD8 clone SK1 | Biolegend | 344710 | PerCP-Cy5.5 conjugated |
| Biosafaty cabinet level 2 | If posible connected to an exauste chimeny when handling Isoflurane | ||
| Bonnet | Fisher scientific | 17-100-900 | Single use cap for basic protection |
| Cavicide | Metrex | 13-1000 | Surface desinfectant |
| CD34+ cells | Lonza | 2C-101 | As many vials available from a single donor |
| Centrifuge | Beckman | 65-6KR | |
| Clear jar | Amazon | 77977 | |
| Cotton gauze pad | Fisher scientific | 22-415-468 | Sterile |
| Disposable lab coats | Fisher scientific | 19-472-422 | |
| EDTA micro tubes | Greiner bio-one | 450480 | |
| Face Mask | Fisher scientific | 17-100-897 | |
| FACS lysing solution | BD | 340202 | |
| FBS premium HI | Atlanta biologicals | S1115OH | |
| Ficoll | GE health one | 17-1440-02 | |
| Flow cytometer | We used FACS Aria II | ||
| Flow cytometry tubes | Falcon | 352054 | 5 ml polystyrene and round bottom |
| HIV BaL | Prepared in our uQUANT core facility | ||
| Human PBMCs | HIV positive and negative volunteers | ||
| Infrared warming pad | Venet scientific | DCT-25 | Temporary therapeutic warming pad for small animals |
| Isentress (Raltegravir) | Merck | NSC 0006-0227061 | Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Integrase inhibitor |
| Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Mark I irradiator | Equipment belonging to university of Maryland | ||
| Micro pipettes | |||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Mouse ear tags | National Band & Tag company | 1005-1L1 | |
| Natelson blood collection tubes | Fisher scientific | 02-668-10 | |
| NOG-EXL | Taconic | HSCFTL-13395-F | |
| NSG mice | Jackson | 5557 | Time pregnant females for CD34 engraftment and Juveniles for PBMCs engraftment |
| NSG-SGM3 | Jackson | 13062 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron microscopy sciences | 15710 | |
| PBS 1X pH 7.4 | Gibco | 100-10-023 | |
| Petri dishes | Fisher scientific | 08-757-28 | |
| Quantistudio qPCR machine | Thermo | QS3 | |
| Reagent reservoirs | Costar | 4870 | |
| RPMI media 1640 1X | Gibco | 11875-093 | |
| Shoe covers | Fisher scientific | 17-100-911 | |
| Sterile disposable Gloves | Microflex | SUF-524 | |
| SuperScript II First-Strand Synthesis SuperMix | Invitrogen | 10080-400 | cDNA synthesis |
| Syringes 28-G x 1/2 | BD | 329-461 | |
| Syringes 29-G x 1/2 | BD | 324-702 | |
| Truvada (Emtricitabine and Tenofovir | Gilead | NDC 61958-0701-1 | Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Nicleoside analog-transcriptase inhibitor |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | Cell count and viability |
| Vick Vaporub | School health | 43214 | Ointment based on menthol and eucalyptus |
| Water molecular biology grade | Quality biological | 351-029-131 |
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