Summary

Humanized Immunoficient Mouse Modellerinde Kronik, Akut ve Yeniden Aktive HIV Enfeksiyonu

Published: December 03, 2019
doi:

Summary

Burada insanlaşmış farelerde HIV enfeksiyonu dinamikleri incelenmesi için üç deneysel yaklaşımlar açıklanmıştır. İlk ivedi kronik enfeksiyon olaylarının incelenmesine izin vererken, ikincisi primer enfeksiyon veya viral reaktivasyon sonrası akut olayların incelenmesine izin verir.

Abstract

Humanized NOD/SCID/IL-2 reseptör γ-chainnull fareler bulaşıcı hastalıklar üzerinde temel ve klinik öncesi araştırmalarda yararlanılabilir insan bağışıklığı, bazı özellikleri recapitulate. Burada açıklanan HIV enfeksiyonu dinamikleri incelemek için insanlaşmış immüneksik farelerin üç modeli vardır. Bunlardan ilki, yeni doğan farelerde CD34+ hematopoetik kök hücrelerin intrahepatik enjeksiyonuna dayanır, bu da birkaç kan ve lenfoid doku ile sınırlı hücrelerin yeniden yapılandırılmasına olanak sağlar ve bunu referans HIV türü ile enfeksiyon takip eder. Bu model enfeksiyon sonrası 36 haftaya kadar izlenmesine olanak sağlar ve bu nedenle kronik model olarak adlandırılır. İkinci ve üçüncü modeller, periferik kan mononükleer hücrelerinin erişkin farelere intraperitoneal enjekte edildiği akut ve reaktivasyon modelleri olarak adlandırılır. Akut modelde, sağlıklı bir donörden hücreler intraperitoneal yol ile engrafted, bir referans HIV suşu ile enfeksiyon takip. Son olarak, reaktivasyon modelinde, antiretroviral tedavi altında HIV ile enfekte donör hücreleri intraperitoneal rota ile engrafted. Bu durumda, fare bir ilaç içermeyen ortam virüs reaktivasyonu ve viral yük artışı sağlar. Burada sağlanan protokoller HIV enfeksiyonu insanlaşmış, immüneksik fare modelleri için geleneksel deneysel yaklaşım açıklar.

Introduction

Humanized NOD / SCID / interlökin (IL)-2 reseptör γ-chainnull (bundan böyle huNS γ-chainnullolarak anılacaktır) fare modeli yaygın enfeksiyonların patogenezi incelemek için kullanılmıştır, otoimmünite, ve kanser, yanı sıra ilaçların ve insan hücre tabanlı tedavilerin pre-klinik çalışmalar için1,2. Bu fareler, il-2 reseptör γ-chain locus (IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 ve IL-21 için ortak γ-chain) scid mutasyon ve hedeflenen mutasyon ile, obez olmayan bir diyabetik (NOD) arka plan dayanmaktadır, hangi fare T-, B-ve doğal katil gelişiminde ciddi bir bozulmaya neden (NK) hücreleri1. Böylece, insan dokusunun engraftment destek, insan CD34+ hematopoetik kök hücreler (HSCs), ve insan periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs)3,4,5. Buna ek olarak, kök hücre faktörü (SCF), granülosit/ makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) ve IL-3 gibi insan hematopoetik faktörlerin transgenik ekspresyonu6,7,8.

HIV çalışmaları için, fare suş farklı birkaç huNS γ-zincirnull fare modelleri, tanımlanmıştır, kullanılan insan hücrelerinin türü, engraftment için dokuların türü, ve hücrelerin kökeni (yani, sağlıklı vs. HIV bulaşmış donör)9,10. Orijinal suşu, ancak, yaygın bir referans HIV suş11,12,13ile enfeksiyon aşağıdaki insan hücrelerinin engraftment ve viral çoğaltma yüksek düzeyde nedeniyle kullanılır. İnsan hematopoetik faktörlerinin transgenik ekspresyonu ile benzer immünoyfik fare suşları (örn. NOG-EXL veya NSG-SGM3) veya insan karaciğeri ve timus dokularının implantları ile (kemik iliği-karaciğer-timus [BLT] fareler) anti-HIV bağışıklık yanıtı miyeloid popülasyonların rolünü değerlendirmek için yararlıdır, bu dokular üzerinde HIV etkileri, ve viral rezervuarlar olarak katılım14,15. Ayrıca, insan lökosit antijen (HLA) moleküllerinin transgenik ekspresyonu ile bazı suşları, yanı sıra BLT fareler, HIV enfeksiyonu16,17T-hücre yanıtı çalışması için kullanılabilir.

Genel olarak, bu farelerde, insanlaşma hücresel kökenli bağlıdır, doğum güzergahı (intraperitoneal, intrahepatik, intravenöz, intrakardiyak) ve engraftment anda fare yaşı18,19,20. Hücre kökeni ile ilgili olarak, insan CD34+ HSC kordon kanı, fetal karaciğer, ya da seferber periferik kan elde edilen yenidoğan veya gençfarelerdeenjekte edilebilir 3,21. Buna ek olarak, yetişkin γ-zincirnull fareler PBMC enjeksiyonu ile insancıl olabilir (burada, hu-PBL-NS γ-zincirnull fareler olarak anılacaktır), kanda bu hücrelerin zamansal dolaşımını sağlayan, ikincil lenfoid organlar, ve iltihaplı dokular22,23,24.

Burada açıklanan HIV enfeksiyonu çalışması için huNS γ-chainnull fare modelleri kurulması için ayrıntılı bir protokoldür. Bunlardan ilki, sağlıklı bir donörden kordon kanından elde edilen insan CD34+ HSC’lerinin yeni doğan farelere enjekte edildiği, ardından 14 haftalık insan bağışıklık sisteminin yeniden yapılandırılmasından sonra referans HIV türü ile enfeksiyon kapıldığı kronik modeldir. Bu model, farelerin enfeksiyondan sonra ~36 haftaya kadar izlenmesini sağlar. İkinci model akut bir modeldir, hangi PBMCs sağlıklı bir donör elde yetişkin NS γ-chainnull fareler enjekte edilir, fare insan T-hücre genişleme 3 hafta sonra bir referans HIV suşu ile enfeksiyon takip. Son olarak, üçüncü model reaktivasyon modeli, hangi PBMCs baskılayıcı antiretroviral tedavi altında HIV enfekte donör türetilen (ART) yetişkin NS γ-chainnull fareler enjekte edilir. Bu durumda, ilaçsız bir ortam viral reaktivasyon ve viral yük artışı sağlar. İki ikinci model engraftment sonra ~ 9 hafta ya kadar izleme sağlar.

Genel olarak, bu üç model virolojik çalışmalar, yeni ilaçların klinik öncesi çalışmalar ve küresel bağışıklık yanıtı hiv enfeksiyonu etkilerinin değerlendirilmesi için yararlıdır. Ayrıca, HIV’li insanlaşmış farelerin kullanımının herhangi bir deneyden önce Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (IBC) ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından gözden geçirilmesi ve onaylanması gerektiğini de göz önünde bulundurmak önemlidir. Bu, çalışmanın tehlikeli biyolojik maddelerin kullanımı ve deneysel hayvanların insancıl kullanımı için tüm iç ve dış kurumsal düzenlemeleri takip etmesini sağlar.

Protocol

Bu çalışmada, Maryland Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından incelenen ve onaylanan protokollere göre tüm hayvan bakımı ve prosedürleri gerçekleştirilmiştir (protokol numaraları 1018017, 1018018 ve 0318009). 1. İnsan CD34+ HSC yenidoğan farelerin engraftment Steril önlükler, eldivenler, özel ayakkabılar, ayakkabı kılıfları, maske, gözlük, saç/sakal kaputu ve steril laboratuvar önlükleri dah…

Representative Results

Yukarıda açıklandığı gibi, 14 hafta post-HSC enjeksiyon (kronik model) veya 3 hafta post-PBMC enjeksiyon (akut ve reaktivasyon modelleri), fareler akış sitometri ile insan hücrelerinin engraftment düzeyini taramalar için kanayan vardır. 1) insan CD45+ hücrelerin yeniden yapılandırılması ve 2) CD4+ ve CD8+ T-hücrelerinin yüzdesi için temsili bir gating stratejisi Şekil 1A’dagösterilmiştir. Tipik olarak, engraftment düze…

Discussion

İnsanlaşma için immünoeksik fare suşlarının geliştirilmesinde önemli ilerlemeler sağlanmıştır, araştırma ilgi1göre kullanılabilecek farklı seçenekler bir dizi ile. Burada ns γ-zincirnull fareler ve genetik olarak benzer suşları HIV enfeksiyonu eğitimi için üç farklı modelde istihdam edilecek insanlaşma için genel bir protokol sağlanan. İlk deneysel yaklaşımda, ışınlanmış yenidoğan fareler insan CD34ile enjekte edilir + HSCs, hangi kordon…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma JCZ Için IHV klinik bölümü iç fonlar tarafından desteklenmiştir.

Materials

0. 5 ml Microcentrifuge tubes Neptune 3735.S.X
1. 5 ml Microcentrifuge tubes Neptune 3745.S.X
10 ml Serologial pipetes stellar sceintific VL-4090-0010
15 ml conical tubes Stellar scientific T15-600
25 ml Serologial pipetes stellar sceintific VL-4090-0025
5 ml Serologial pipetes stellar sceintific VL-4090-0005
50 ml conical tubes Stellar scientific T50-600
ACK lysis buffer Quality biological 118-156-101
Alcohol prep pads Fisher scientific 06-669-62 Sterile
Anti-Human CD3 clone UCHT1 Biolegend 300439 APC conjugated
Anti-Human CD4 clone OKT4 Biolegend 317420 AF488 conjugated
Anti-Human CD45 clone 2D1 Biolegend 368522 BV421 conjugated
Anti-Human CD8 clone SK1 Biolegend 344710 PerCP-Cy5.5 conjugated
Biosafaty cabinet level 2 If posible connected to an exauste chimeny when handling Isoflurane
Bonnet Fisher scientific 17-100-900 Single use cap for basic protection
Cavicide Metrex 13-1000 Surface desinfectant
CD34+ cells Lonza 2C-101 As many vials available from a single donor
Centrifuge Beckman 65-6KR
Clear jar Amazon 77977
Cotton gauze pad Fisher scientific 22-415-468 Sterile
Disposable lab coats Fisher scientific 19-472-422
EDTA micro tubes Greiner bio-one 450480
Face Mask Fisher scientific 17-100-897
FACS lysing solution BD 340202
FBS premium HI Atlanta biologicals S1115OH
Ficoll GE health one 17-1440-02
Flow cytometer We used FACS Aria II
Flow cytometry tubes Falcon 352054 5 ml polystyrene and round bottom
HIV BaL Prepared in our uQUANT core facility
Human PBMCs HIV positive and negative volunteers
Infrared warming pad Venet scientific DCT-25 Temporary therapeutic warming pad for small animals
Isentress (Raltegravir) Merck NSC 0006-0227061 Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Integrase inhibitor
Isoflurane Henry Schein NDC 11695-6776-2
Mark I irradiator Equipment belonging to university of Maryland
Micro pipettes
Microcentrifuge Eppendorf
Mouse ear tags National Band & Tag company 1005-1L1
Natelson blood collection tubes Fisher scientific 02-668-10
NOG-EXL Taconic HSCFTL-13395-F
NSG mice Jackson 5557 Time pregnant females for CD34 engraftment and Juveniles for PBMCs engraftment
NSG-SGM3 Jackson 13062
Paraformaldehyde 16% Electron microscopy sciences 15710
PBS 1X pH 7.4 Gibco 100-10-023
Petri dishes Fisher scientific 08-757-28
Quantistudio qPCR machine Thermo QS3
Reagent reservoirs Costar 4870
RPMI media 1640 1X Gibco 11875-093
Shoe covers Fisher scientific 17-100-911
Sterile disposable Gloves Microflex SUF-524
SuperScript II First-Strand Synthesis SuperMix Invitrogen 10080-400 cDNA synthesis
Syringes 28-G x 1/2 BD 329-461
Syringes 29-G x 1/2 BD 324-702
Truvada (Emtricitabine and Tenofovir Gilead NDC 61958-0701-1 Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Nicleoside analog-transcriptase inhibitor
Trypan blue Sigma T8154 Cell count and viability
Vick Vaporub School health 43214 Ointment based on menthol and eucalyptus
Water molecular biology grade Quality biological 351-029-131

References

  1. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7, 118-130 (2007).
  2. Koboziev, I., et al. Use of humanized mice to study the pathogenesis of autoimmune and inflammatory diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (7), 1652-1673 (2015).
  3. Ito, M., et al. NOD/SCID/γcnull mouse: An excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  4. Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
  5. Kim, K. C., et al. A Simple Mouse Model for the Study of Human Immunodeficiency Virus. AIDS research and human retroviruses. 32 (2), 194-202 (2016).
  6. Wunderlich, M., et al. AML xenograft efficiency is significantly improved in NOD/SCID-IL2RG mice constitutively expressing human SCF, GM-CSF and IL-3. Leukemia. 24 (10), 1785-1788 (2010).
  7. Billerbeck, E., et al. Development of human CD4+FoxP3+ regulatory T cells in human stem cell factor-, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-, and interleukin-3-expressing NOD-SCID IL2Rγnull humanized mice. Blood. 117 (11), 3076-3086 (2011).
  8. Coughlan, A. M., et al. Myeloid Engraftment in Humanized Mice: Impact of Granulocyte-Colony Stimulating Factor Treatment and Transgenic Mouse Strain. Stem cells and development. 25 (7), 530-541 (2016).
  9. Kumar, P., et al. T Cell-Specific siRNA Delivery Suppresses HIV-1 Infection in Humanized Mice. Cell. 134 (4), 577-586 (2008).
  10. Victor Garcia, J. Humanized mice for HIV and AIDS research. Current Opinion in Virology. 19, 56-64 (2016).
  11. Araínga, M., Su, H., Poluektova, L. Y., Gorantla, S., Gendelman, H. E. HIV-1 cellular and tissue replication patterns in infected humanized mice. Scientific Reports. 6, 1-12 (2016).
  12. Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational ART. Journal of Virology. 92 (7), 2118 (2018).
  13. Medina-Moreno, S., et al. Targeting of CDK9 with indirubin 3’-monoxime safely and durably reduces HIV viremia in chronically infected humanized mice. PLoS ONE. 12 (8), 1-13 (2017).
  14. Honeycutt, J. B., et al. Macrophages sustain HIV replication in vivo independently of T cells. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1353-1366 (2016).
  15. Perdomo-Celis, F., Medina-Moreno, S., Davis, H., Bryant, J., Zapata, J. C. HIV Replication in Humanized IL-3/GM-CSF-Transgenic NOG Mice. Pathogens. 8 (33), 1-16 (2019).
  16. Akkina, R., et al. Improvements and Limitations of Humanized Mouse Models for HIV Research: NIH/NIAID “Meet the Experts” 2015 Workshop Summary. AIDS Research and Human Retroviruses. 32 (2), 109-119 (2015).
  17. Dudek, T. E., Allen, T. M. HIV-Specific CD8+ T-Cell Immunity in Humanized Bone Marrow-Liver-Thymus Mice. The Journal of Infectious Diseases. 208, 150-154 (2013).
  18. Skelton, J. K., Ortega-Prieto, A. M., Dorner, M. A Hitchhiker’s guide to humanized mice: new pathways to studying viral infections. Immunology. 154, 50-61 (2018).
  19. Pearson, T., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Creation of “humanized” mice to study human immunity. Current Protocols in Immunology. , (2008).
  20. Hasgur, S., Aryee, K. E., Shultz, L. D., Greiner, D. L., Brehm, M. A. Generation of Immunodeficient Mice Bearing Human Immune Systems by the Engraftment of Hematopoietic Stem Cells. Methods in molecular biology. 1438, 67-78 (2016).
  21. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
  22. King, M., et al. A new Hu-PBL model for the study of human islet alloreactivity based on NOD-scid mice bearing a targeted mutation in the IL-2 receptor gamma chain gene. Clinical Immunology. 126 (3), 303-314 (2008).
  23. King, M. A., et al. Human peripheral blood leucocyte non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency interleukin-2 receptor gamma chain gene mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host major histocompatibility complex. Clinical and Experimental Immunology. 157 (1), 104-118 (2009).
  24. Covassin, L., et al. Human peripheral blood CD4 T cell-engrafted non-obese diabetic-scid IL2rgamma(null) H2-Ab1 (tm1Gru) Tg (human leucocyte antigen D-related 4) mice: a mouse model of human allogeneic graft-versus-host disease. Clinical and experimental immunology. 166 (2), 269-280 (2011).
  25. Heredia, A., et al. Targeting of mTOR catalytic site inhibits multiple steps of the HIV-1 lifecycle and suppresses HIV-1 viremia in humanized mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9412-9417 (2015).
  26. Nair, A., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
  27. Miller, P. H., et al. Analysis of parameters that affect human hematopoietic cell outputs in mutant c-kit-immunodeficient mice. Experimental Hematology. 48, 41-49 (2017).
  28. Murphy, W. J., et al. Induction of T cell differentiation and lymphomagenesis in the thymus of mice with severe combined immune deficiency (SCID). Journal of Immunology. 153 (3), 1004-1014 (1994).
  29. Poluektova, L. Y., et al. Humanized Mice as Models for Human Disease. Humanized Mice for HIV Research. , 15-24 (2015).
  30. Nakata, H., et al. Potent anti-R5 human immunodeficiency virus type 1 effects of a CCR5 antagonist, AK602/ONO4128/GW873140, in a novel human peripheral blood mononuclear cell nonobese diabetic-SCID, interleukin-2 receptor gamma-chain-knocked-out AIDS mouse model. Journal of Virology. 79 (4), 2087-2096 (2005).
  31. Terahara, K., et al. Fluorescent Reporter Signals, EGFP, and DsRed, Encoded in HIV-1 Facilitate the Detection of Productively Infected Cells and Cell-Associated Viral Replication Levels. Frontiers in Microbiology. 2, 280 (2012).
  32. Nicolini, F. E., Cashman, J. D., Hogge, D. E., Humphries, R. K., Eaves, C. J. NOD/SCID mice engineered to express human IL-3, GM-CSF and Steel factor constitutively mobilize engrafted human progenitors and compromise human stem cell regeneration. Leukemia. 18 (2), 341-347 (2004).
  33. Cyster, J. G., et al. Follicular stromal cells and lymphocyte homing to follicles. Immunological Reviews. 176, 181-193 (2000).
  34. Seung, E., Tager, A. M. Humoral Immunity in Humanized Mice: A Work in Progress. Journal of Infectious Diseases. 208, 155-159 (2013).
  35. Wahl, A., Victor Garcia, J. The use of BLT humanized mice to investigate the immune reconstitution of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 410, 28-33 (2014).
  36. Suzuki, M., et al. Induction of human humoral immune responses in a novel HLA-DR-expressing transgenic NOD/Shi-scid/γc null mouse. International Immunology. 24 (4), 243-252 (2012).
  37. Ali, N., et al. Xenogeneic Graft-versus-Host-Disease in NOD-scid IL-2Rγnull Mice Display a T-Effector Memory Phenotype. PLoS ONE. 7 (8), 1-10 (2012).
  38. Brehm, M. A., Wiles, M. V., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Generation of improved humanized mouse models for human infectious diseases. Journal of Immunological Methods. 410, 3-17 (2014).
  39. Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. HIV latency: experimental systems and molecular models. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).
  40. Wu, F., et al. TRIM5α Restriction Affects Clinical Outcome and Disease Progression in Simian Immunodeficiency Virus-Infected Rhesus Macaques. Journal of Virology. 89 (4), 2233 (2015).

Play Video

Cite This Article
Perdomo-Celis, F., Medina-Moreno, S., Heredia, A., Davis, H., Bryant, J., Zapata, J. C. Chronic, Acute, and Reactivated HIV Infection in Humanized Immunodeficient Mouse Models. J. Vis. Exp. (154), e60315, doi:10.3791/60315 (2019).

View Video