Chronische, akute und reaktivierte HIV-Infektion in humanisierten immundefizienten Mausmodellen
Summary
Hier werden drei experimentelle Ansätze beschrieben, um die Dynamik der HIV-Infektion bei humanisierten Mäusen zu untersuchen. Die erste erlaubt die Untersuchung chronischer Infektionsereignisse, während letztere die Untersuchung akuter Ereignisse nach primärer Infektion oder viraler Reaktivierung ermöglicht.
Abstract
Humanisierte NOD/SCID/IL-2-Rezeptor-Null-Mäuse rekapitulieren einige Merkmale der menschlichen Immunität, die in der grundlegenden und präklinischen Forschung an Infektionskrankheiten genutzt werden können. Hier sind drei Modelle von humanisierten immundefizienten Mäusen beschrieben, um die Dynamik einer HIV-Infektion zu untersuchen. Die erste basiert auf der intrahepatischen Injektion von CD34+ hämatopoetischen Stammzellen bei neugeborenen Mäusen, die die Rekonstitution mehrerer Blut- und Lymphgewebezellen ermöglicht, gefolgt von einer Infektion mit einem Referenz-HIV-Stamm. Dieses Modell ermöglicht die Überwachung von bis zu 36 Wochen nach der Infektion und wird daher als chronisches Modell bezeichnet. Das zweite und dritte Modell werden als die akuten und Reaktivierungsmodelle bezeichnet, bei denen periphere mononukleäre Blutzellen intraperitoneal in erwachsene Mäuse injiziert werden. Im akuten Modell werden Zellen eines gesunden Spenders über den intraperitonealen Weg transplantiert, gefolgt von einer Infektion mit einem Referenz-HIV-Stamm. Schließlich werden im Reaktivierungsmodell Zellen eines HIV-infizierten Spenders unter antiretroviraler Therapie über den intraperitonealen Weg transplantiert. In diesem Fall ermöglicht eine medikamentenfreie Umgebung in der Maus eine Virusreaktivierung und eine Erhöhung der Viruslast. Die hier bereitgestellten Protokolle beschreiben den konventionellen experimentellen Ansatz für humanisierte, immundefizienten Mausmodelle einer HIV-Infektion.
Introduction
Das humanisierte Mausmodell NOD/SCID/interleukin (IL)-2-Rezeptor-Chain null (im Folgenden als huNS-Kettenullbezeichnet) wurde häufig zur Untersuchung der Pathogenese von Infektionen, Autoimmunität und Krebs sowie für präklinische Studien von Medikamenten und humanzellbasierten Therapien1,2verwendet. Diese Mäuse basieren auf einem nicht-fettleibigen Diabetiker (NOD) Hintergrund, mit der scid-Mutation und gezielten Mutation am IL-2-Rezeptor-Ketten-Lokus (gemeinsame Kette für IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 und IL-21), die eine schwere Beeinträchtigung in der Entwicklung von Maus-T-, B-, und natürlichen Killerzellen (NK) verursachen, die eine schwere Beeinträchtigung in der Entwicklung von Maus-T-, B- und natürlichen Killerzellen (NK)verursachen. So unterstützen sie die Engraftierung von menschlichem Gewebe, humanen CD34+ hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) und menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs)3,4,5. Darüber hinaus fördert die transgene Expression menschlicher hämatopoetischer Faktoren, wie Stammzellenfaktor (SCF), Granulozyt/Makrophagenkolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF), und IL-3 die Engraftmentierung menschlicher Myeloidpopulationen6,7,8.
Für HIV-Studien wurden mehrere huNS-Kette Null-Maus-Modelle beschrieben, die sich in der Maus Stamm, Art der verwendeten menschlichen Zellen, Art des Gewebes für die Engraftment und Herkunft der Zellen (d.h. gesund vs. HIV-infizierter Spender)9,10. Der ursprüngliche Stamm ist jedoch aufgrund der hohen Konzentration menschlicher Zellen und der Virusreplikation nach einer Infektion mit einem Referenz-HIV-Stamm11,12,13weit verbreitet. Ähnliche immundefiziöse Mausstämme mit transgener Expression menschlicher hämatopoetischer Faktoren (z. B. NOG-EXL oder NSG-SGM3) oder mit Implantaten menschlicher Leber- und Thymusgewebe (Knochenmark-Leber-Thymus [BLT]-Mäuse) sind nützlich für die Bewertung der Rolle von Myeloidpopulationen bei der Anti-HIV-Immunantwort, den Auswirkungen von HIV auf diese Gewebe und deren Beteiligung als Virusreservoir14,15. Darüber hinaus können einige Stämme mit transgener Expression von humanen Leukozyten-Antigen (HLA)-Molekülen sowie BLT-Mäusen zur Untersuchung der T-Zell-Reaktion auf HIV-Infektionen16,17verwendet werden.
Im Allgemeinen hängt die Humanisierung bei diesen Mäusen vom zellulären Ursprung, dem Verabreichungsweg (intraperitoneal, intrahepatisch, intravenös, intrakardial) und dem Mausalter zum Zeitpunkt der Transplantation18,19,20ab. In Bezug auf den Zellursprung können menschliche CD34+ HSC aus Nabelschnurblut, fetaler Leber oder mobilisiertem peripherem Blut bei neugeborenen oder jungen Mäusen injiziert werden3,21. Darüber hinaus können erwachseneNull-Mäuse durch Injektion von PBMC (hier als hu-PBL-NS-Kettenull-Mäuse bezeichnet) humanisiert werden, was die zeitliche Zirkulation dieser Zellen im Blut, sekundären Lymphorganen und entzündeten Geweben22,23,24ermöglicht.
Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Etablierung von huNS-Kette Null-Maus-Modellen für die Untersuchung von HIV-Infektionen beschrieben. Das erste ist das chronische Modell, bei dem menschliche CD34+ HSCs, die aus Nabelschnurblut von einem gesunden Spender stammen, bei neugeborenen Mäusen injiziert werden, gefolgt von einer Infektion mit einem Referenz-HIV-Stamm nach 14 Wochen Rekonstitution des menschlichen Immunsystems. Dieses Modell ermöglicht die Überwachung von Mäusen für bis zu 36 Wochen nach der Infektion. Das zweite Modell ist ein akutes Modell, bei dem PBMCs, die von einem gesunden Spender abgeleitet wurden, in erwachsene NS-Kettenull Mäuse injiziert werden, gefolgt von einer Infektion mit einem Referenz-HIV-Stamm nach 3 Wochen menschlicher T-Zell-Expansion in der Maus. Das dritte Modell schließlich ist das Reaktivierungsmodell, bei dem PBMCs, die von einem HIV-infizierten Spender im Rahmen einer unterdrückenden antiretroviralen Therapie (ART) abgeleitet wurden, in adulte NS-Kettenull Mäuse injiziert werden. In diesem Fall ermöglicht eine medikamentenfreie Umgebung eine virale Reaktivierung und eine Erhöhung der Viruslast. Die beiden letztgenannten Modelle ermöglichen eine Überwachung von bis zu 9 Wochen nach der Transplantation.
Insgesamt sind diese drei Modelle nützlich für virologische Studien, präklinische Studien neuartiger Medikamente und die Bewertung der Auswirkungen von HIV-Infektionen auf die globale Immunantwort. Es ist auch wichtig zu berücksichtigen, dass die Verwendung von HIV-infizierten humanisierten Mäusen vor jedem Experiment eine Überprüfung und Genehmigung durch den Institutional Biosafety Committee (IBC) sowie durch den Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) erfordert. Dadurch wird sichergestellt, dass die Studie alle internen und externen institutionellen Vorschriften für die Verwendung von gefährlichem biologischem Material und den humanen Umgang mit Versuchstieren befolgt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wichtige Fortschritte wurden bei der Entwicklung von immundefizienten Mausstämmen für die Humanisierung erzielt, mit einer Reihe von verschiedenen Optionen, die je nach Forschungsinteresse verwendet werden können1. Hier ist ein allgemeines Protokoll zur Humanisierung von NS-Kettenull Mäuse n und genetisch ähnliche Stämme in drei verschiedenen Modellen für die Untersuchung von HIV-Infektion verwendet werden. Im ersten experimentellen Ansatz werden bestrahlte neugeborene Mäuse mit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von den internen Fonds der Klinischen Abteilung IHV an JCZ unterstützt.
Materials
| 0. 5 ml Microcentrifuge tubes | Neptune | 3735.S.X | |
| 1. 5 ml Microcentrifuge tubes | Neptune | 3745.S.X | |
| 10 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0010 | |
| 15 ml conical tubes | Stellar scientific | T15-600 | |
| 25 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0025 | |
| 5 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0005 | |
| 50 ml conical tubes | Stellar scientific | T50-600 | |
| ACK lysis buffer | Quality biological | 118-156-101 | |
| Alcohol prep pads | Fisher scientific | 06-669-62 | Sterile |
| Anti-Human CD3 clone UCHT1 | Biolegend | 300439 | APC conjugated |
| Anti-Human CD4 clone OKT4 | Biolegend | 317420 | AF488 conjugated |
| Anti-Human CD45 clone 2D1 | Biolegend | 368522 | BV421 conjugated |
| Anti-Human CD8 clone SK1 | Biolegend | 344710 | PerCP-Cy5.5 conjugated |
| Biosafaty cabinet level 2 | If posible connected to an exauste chimeny when handling Isoflurane | ||
| Bonnet | Fisher scientific | 17-100-900 | Single use cap for basic protection |
| Cavicide | Metrex | 13-1000 | Surface desinfectant |
| CD34+ cells | Lonza | 2C-101 | As many vials available from a single donor |
| Centrifuge | Beckman | 65-6KR | |
| Clear jar | Amazon | 77977 | |
| Cotton gauze pad | Fisher scientific | 22-415-468 | Sterile |
| Disposable lab coats | Fisher scientific | 19-472-422 | |
| EDTA micro tubes | Greiner bio-one | 450480 | |
| Face Mask | Fisher scientific | 17-100-897 | |
| FACS lysing solution | BD | 340202 | |
| FBS premium HI | Atlanta biologicals | S1115OH | |
| Ficoll | GE health one | 17-1440-02 | |
| Flow cytometer | We used FACS Aria II | ||
| Flow cytometry tubes | Falcon | 352054 | 5 ml polystyrene and round bottom |
| HIV BaL | Prepared in our uQUANT core facility | ||
| Human PBMCs | HIV positive and negative volunteers | ||
| Infrared warming pad | Venet scientific | DCT-25 | Temporary therapeutic warming pad for small animals |
| Isentress (Raltegravir) | Merck | NSC 0006-0227061 | Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Integrase inhibitor |
| Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Mark I irradiator | Equipment belonging to university of Maryland | ||
| Micro pipettes | |||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Mouse ear tags | National Band & Tag company | 1005-1L1 | |
| Natelson blood collection tubes | Fisher scientific | 02-668-10 | |
| NOG-EXL | Taconic | HSCFTL-13395-F | |
| NSG mice | Jackson | 5557 | Time pregnant females for CD34 engraftment and Juveniles for PBMCs engraftment |
| NSG-SGM3 | Jackson | 13062 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron microscopy sciences | 15710 | |
| PBS 1X pH 7.4 | Gibco | 100-10-023 | |
| Petri dishes | Fisher scientific | 08-757-28 | |
| Quantistudio qPCR machine | Thermo | QS3 | |
| Reagent reservoirs | Costar | 4870 | |
| RPMI media 1640 1X | Gibco | 11875-093 | |
| Shoe covers | Fisher scientific | 17-100-911 | |
| Sterile disposable Gloves | Microflex | SUF-524 | |
| SuperScript II First-Strand Synthesis SuperMix | Invitrogen | 10080-400 | cDNA synthesis |
| Syringes 28-G x 1/2 | BD | 329-461 | |
| Syringes 29-G x 1/2 | BD | 324-702 | |
| Truvada (Emtricitabine and Tenofovir | Gilead | NDC 61958-0701-1 | Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Nicleoside analog-transcriptase inhibitor |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | Cell count and viability |
| Vick Vaporub | School health | 43214 | Ointment based on menthol and eucalyptus |
| Water molecular biology grade | Quality biological | 351-029-131 |
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