ショウジョウバエメラメラノガスターにおける学習誘発シナプス可塑性の生体内光学カルシウムイメージング

学習を通じて脳内で情報を取得し、その後メモリとして保存する場所と方法を解読することは、神経^科学1の中で最も困難なタスクの1つです。神経科学的研究は、学習と記憶^形成2、3の根底にあるニューロン基板としてのシナプス伝達の変化の概念につながっています。学習中に、刺激の知覚中に活動するニューロンアンサンブル間のシナプス接続が、記憶リコール中にそれらの結合された活動パターンを取り出すことができるよう変更され、それによって指示されるのが仮説である。将来の行動行動⁴.これらの「エングラム細胞」とそのシナプスは、多くの場合、脳領域と処理のレベルに分散され、タスクまたは刺激の学習にシナプス伝達の観察された変化を割り当てることが困難になります。特定の学習タスクに因果的にリンクされているシナプスの変更をローカライズして視覚化するには、それらのシナプスを正確に限定できる適切なモデル システムが必要です。

このような試みのために、ショウジョウバエメラノガスターは、相対的な脳の単純さ、行動の豊かさ、および実験的なアクセシビリティを兼ね備えているため、特に適しています。確立されたモデル生物の中で、ショウジョウバエは、線虫C.エレガンスと神経の複雑さの面でマウスのような遺伝的に扱いやすい哺乳類の間に位置しています。C.エレガンスでは、ニューロンの立体数(〜300)と限られた行動レパートリーが観察される。一方、哺乳類は何百万ものニューロンを持ち、驚異的な行動の複雑さを持っています。フルーツフライの脳は、その〜100,000で、ほとんどの脊椎動物の脳よりも有意に小さいニューロンであり、ニューロンの多くは個別に^{識別可能5}である。しかし、ショウジョウバエは、40年以上前に最初に説明された、堅牢な連想嗅覚学習および記憶形成を示す能力を含む、複雑な行動の広いスペクトルを示^す6。この古典的な調節手順の過程で、ハエの群れは、条件付き^刺激(CS+)として臭いを受け、無条件刺激(米国)として罰せられる感電を受ける。第二の臭い(CS^-)は、任意の罰なしで提示されます。それによって、動物は、2つの臭い、CS+およびCS^{– の}間の後続の選択状況でテストすることができる罰に関連する臭気を避けることを学ぶ。ショウジョウバエにおけるこの行動の根底にある神経基板の解剖に関する研究は、キノコ体(MB)を「エングラム」7、8、9、10の主要部位として同定した。したがって、この脳領域の回路は、メモリエングラムが取得および保存されるロジックを明らかにするために、激しい研究の対象であった(^{最近11、12}で検討)。

ショウジョウバエMBは、半球当たり約2,000個の固有ニューロン(ケニヨン細胞)からなる、並列軸法突^起13で編成される。嗅覚投影ニューロンの軸索は、横プロトセレブラとMBカリセス、MBの主な樹状入力部位に拡張され、アンテナローブからの嗅覚入力を受け取る。ケニヨン細胞の長い平行軸線束は、ペダンクルとローブを構成します。ほとんどのケニヨン細胞は、脳の中線に向かって1つの担保を拡張することにより、水平β/β’-ローブを形成し、後部前方向に2番目の担保を伸ばすことによって垂直α/α’-ローブを二股に形成する。ケニヨン細胞の他のグループは、学習プロセスおよびその後の短期記憶形成^が10に局在することができるMBの水平γ-^葉13を形成する。MBローブは、アフェレント入力を受け取り、エフェレント出力を提供し、どちらも通常、ケニヨンセル軸に沿った別個の区画サブ領域に制限されています^14,15^,16.特に、アフェレント・ドーパミン作動性MB入力ニューロンは、価値ベースを仲介することが示されており、例えば、懲罰的、連想嗅覚学習における効果を強化^{する15、17。}キノコの体葉からのステレオタイピックおよび個別に識別可能なEFFerent MB出力ニューロンは、多数のケニヨン細胞間で情報を統合し、多様な脳領域を標的とし、行動に有益な食欲または嫌悪情報¹⁵.このニューロンアーキテクチャは、連想エングラムの組織の概念につながっています。臭気は、ケニヨン細胞のまばらに活性化されたアンサンブルによって比較的正確にコードされる。これらのケニヨン細胞アンサンブルの偶然の活動とドーパミンの放出 – 刺激を罰することによって誘発される – 動物は、その後、動物が後でこの特定の匂いを避けるようにMB出力ニューロンにケニヨン細胞プレシナプスからの伝達を調節します^{10 、12}.このエングラムをパラダイマティックなケースとして使用し、シナプス活性におけるこれらの学習依存的変化をどのように決定および監視するかを示します。

モデルシステムとしてのショウジョウバエの価値は、複雑な回路内の単一ニューロンを同定、監視、および制御するためのトランス遺伝子を発現することを可能にする比類のない遺伝的ツールボックスに強く依存しています^18.ここで説明するカルシウムイメージングなどの神経活動モニタリングのための技術の出現は、特定の刺激に応答してニューロン活性パターンの決定を可能にした。遺伝的にコードされたカルシウム指標(GEC)の特定のGal4駆動発現と嗅覚刺激を組み合わせることにより、19^の目的のニューロンの臭気誘発カルシウムダイナミクスを可視化することができる。このプロトコルでは、この技術を古典的なコンディショニングパラダイムとさらに結合することにより、学習の文脈でこれらの嗅覚応答を調べことが可能であることを示す。学習誘発可塑性は、単一の特定のニューロンに局在するだけでなく、ニューロンの特定のサブコンパートメントにも局在するGECを使用してさらに解剖することができます。Pech et al.²⁰は、まさにこれを可能にするツールの選択を確立しました。GCaMP3²¹を前または後のナプスに標的化することにより、脊椎動物シナプトフィシンまたはdホーマーへの連結を介して、^{それぞれ20-}これらの部位の差動変調を区別することができる。このローカリゼーションは、この文脈において、サイトソル全体にユビキタスに存在するほとんどのGEC(例えば、GCaMP 22、GCaMP3^21、またはGCaMP6²³⁾に対する優位性を与える。ニューロン活性化の結果として生じる全体的な統合カルシウム流入と区別されます。これは、学習と記憶の形成を引き起こす結果として発生する可塑性の場所と種類に関する手がかりを提供することができます。一例として、ここで提供されるプロトコルは、カルシウムセンサの発現をポストシナプスのみに標的化することにより、嗅覚連想学習中のMB出力ニューロンの変調を解読する際のこのツールの価値を示す。モニタリングすることにより、個々のハエの中で、嗅覚調節の前後に臭気誘発活性を、ナイーブな臭気応答と学習された臭気応答との間で直接比較することができる。同じイメージングチャンバーに固定されている間、ハエは臭いの選択にさらされています。次に、これらの臭気の1つが電気^{ショック(CS+}になる)と対になり、補強なしで別の臭いが提示される(CS-^になる)逆連想調節プロトコルを受け取ります。最後に、ハエは再び最初のステップと同じ臭いにさらされます。カルシウムダイナミクスは、2光子顕微鏡を用いて観察される。