В Vivo оптические изображения кальция обучения индуцированной синаптической пластичности в Drosophila меланогастер

Расшифровка того, где и как информация приобретается в мозге путем обучения и впоследствии хранится в качестве памяти представляет собой одну из самых сложных задач в неврологии¹. Нейронаучные исследования привели к концепции изменения в синаптической передачи в качестве нейронального субстрата, который лежит в основе обучения и формирования памяти^2,3. Предполагается, что во время обучения синаптические связи между нейрональными ансамблями, которые активны во время восприятия стимула, становятся модифицированными такимобразом, что их комбинированная активность может быть извлечена во время отзыва памяти, тем самым инструктируя будущее поведенческое действие⁴. Эти “энграммные клетки” и их синапсы часто распределены по регионам мозга и уровням обработки, что затрудняет присвоение наблюдаемых изменений в синаптической передаче изучению задачи или стимула. Для локализации и визуализации тех синапических изменений, которые причинно связаны с конкретной задачей обучения, нужна соответствующая модельная система, позволяющая точно сограничировать эти синапсы.

Для такого начинания, Drosophila melanogaster особенно подходит, потому что он сочетает в себе относительную простоту мозга, поведенческое богатство, и экспериментальной доступности. Среди устоявшихся модельных организмов, Drosophila находится между нематод C. elegans и генетически tractable млекопитающих, как мыши с точки зрения нейронной сложности. Стереотипное количество нейронов (300 евро) и ограниченный поведенческий репертуар наблюдаются в C. elegans. Млекопитающие, с другой стороны, имеют миллионы нейронов и ошеломляющей поведенческой сложности. Мозг плодовой мухи, с его 100000 фунтов, нейроны значительно меньше, чем мозг большинства позвоночных, и многие из нейронов индивидуально идентифицируемых⁵. Тем не менее, Drosophila продемонстрировать широкий спектр сложных моделей поведения, в том числе способность проявлять надежное ассоциативное обонятельное обучение и формирование памяти, впервые описано более 40 лет назад⁶. В ходе этой классической процедуры кондиционирования, группы мух подвергаются запаху в качестве условного стимула (CS⁾в то время как они получают наказание электрическим током, как безусловный стимул (США). Второй запах (CS^{– )}затем представлен без какого-либо наказания. Таким образом, животные учатся избегать запаха, связанного с наказанием, которое может быть проверено в последующей ситуации выбора между двумя запахами, CS^и CS^–. Работа по вскрытию нейронального субстрата, лежащего в основе такого поведения в Дрософиле, выявила грибные тела (МБ) в качестве основного места “энграммы”^7,8,9,10 и, следовательно, схема этой области мозга была и является предметом интенсивных исследований, с тем чтобы раскрыть логику, с помощью которой энграмма памяти приобретается и хранится (недавно рассмотрены в^11,12).

Дрозофила МБ состоит из 2000 внутренних нейронов (клеток Кеньона) на полушарие, организованных в параллельных аксональных проекциях¹³. Аксоны обонятельных проекционных нейронов распространяются на боковые протоцеребры и мБ калеки, основной дендритный вхоломестоц МБ и получают обонятельный вход из антенных долей. Длинный параллельный аксоны пучок клеток Кеньон составляют peduncle и долей. Большинство клеток Кеньона раздвоените, образуя горизонтальные доли, расширяя одно обеспечение к средней линии мозга, и вертикальные доли, расширяя второе второе секондирование в направлении дорсал-переднего. Другая группа клеток Кеньона образует горизонтальные доли¹³ МБ, где процесс обучения и последующее кратковременное формирование памяти могут быть локализованы¹⁰. МБ доли получают afferent входив и обеспечивают efferent выход, оба из которых типично ограничены к отдельно расчастью sub-области вдоль аксонов клетки Kenyon^14,15,16. В частности, афферентные дофаминергические mb входные нейроны были показаны посредничать на основе стоимости, например, карательные, усиливающие эффекты в ассоциативном обонятельном обучении^15,17. Стереотипные и индивидуально идентифицируемые эфферентные нейроны выхода МБ из долей грибного тела интегрируют информацию в большом количестве клеток Кеньона, нацелены на различные области мозга и несут поведение-поучительную аппетитную или аверсивную информацию¹⁵ . Эта нейрональная архитектура привела к концепции организации ассоциативной энграммы. Одоры относительно точно кодируются редко активированными ансамблями клеток Кеньона. Совпадение деятельности этих кеньон клеточных ансамблей и выпуск допамина – вызванные наказанием стимулов – модулирует передачу из Кеньон клетки presynapses на выброс нейронов МБ таким образом, что животные будут впоследствии избежать этого конкретного^{запаха 10 ,12}. Мы используем эту довольно точно определенную и локализованную энграмму в качестве парадигматического случая, чтобы проиллюстрировать, как можно определить и контролировать эти обучающие изменения в синаптической активности.

Значение Drosophila как модельная система сильно опирается на непревзойденный генетический инструментарий, который позволяет выразить трансгенов для выявления, мониторинга и контроля отдельных нейронов в сложных схемах¹⁸. Появление методов мониторинга нейронной активности – таких, как изображения кальция, обсуждается здесь – позволили для определения нейронной активности моделей в ответ на конкретный стимул. Комбинируя специфические Gal4-управляемые выражения генетически закодированных индикаторов кальция (GECIs) с обонятельной стимуляцией, можно визуализировать вызванную запахом динамику кальция нейронов, представляющих интерес¹⁹. В этом протоколе показано, что путем дальнейшего соединения этой техники с классической парадигмой кондиционирования, можно изучить эти обонятельные ответы в контексте обучения. Обучение индуцированной пластичности может быть дополнительно вскрыты с помощью GECIs, которые не только локализованы для одного конкретного нейрона, но и для конкретных subcompartments нейрона. Pech et al.²⁰ создали подборку инструментов, которые позволяют именно это. Ориентируясь gCaMP3²¹ либо до или postsynapse – через связь с позвоночных Synaptophysin или dГомер, соответственно²⁰– дифференциальной модуляции этих сайтов можно отличить. Эта локализация предоставляет, в этом контексте, преимущество перед большинством GECIs, которые повсеместно присутствуют во всем цитозоле – например, GCaMP²², GCaMP3²¹, или GCaMP6²³ – потому что это означает, что до и постсинаптических переходных может быть отличается от общего интегрированного притока кальция, который происходит в результате активации нейронов. Это может дать подсказки о местоположении и типах пластичности, которые возникают в результате или которые вызывают обучение и формирование памяти. В качестве примера, протокол, представленный здесь показывает значение этого инструмента в расшифровке модуляции МБ выходных нейронов во время обонятельного ассоциативного обучения, ориентируясь на выражение датчика кальция только postsynapse. Путем контролировать, внутри индивидуальная муха, запах-вызванная деятельность перед и после обонятельного кондиционирования сразу сравнение можно нарисовать между наивным реакцией запаха и выученным реакцией запаха. В то время как фиксированные в той же камере изображения, мухи подвергаются выбор запахов. Затем они получают аверсивный ассоциативный протокол кондиционирования, в котором один из этих запахов в паре с электрическим током (становясь CS⁾и другой запах представлен без подкрепления (становится CS^–). Наконец, мухи снова подвергаются тем же запахам, что и на первом этапе. Динамика кальция наблюдается с помощью двухфотонной микроскопии.