Hier presenteren we een protocol waarmee pre-en/of postsynaptisch calcium kan worden gevisualiseerd in de context van Drosophila leren en geheugen. In vivo calcium beeldvorming met behulp van Synaptisch gelokaliseerde calcium sensoren wordt gecombineerd met een klassieke olfactorische conditionerings paradigma zodanig dat de Synaptische plasticiteit onderliggende dit type associatief leren kan worden bepaald.
Decennia van onderzoek in veel model organismen hebben geleid tot het huidige concept van synaptische plasticiteit onderliggende leren en Geheugenvorming. Learning-geïnduceerde veranderingen in de synaptische transmissie zijn vaak verdeeld over vele neuronen en niveaus van verwerking in de hersenen. Daarom, methoden voor het visualiseren van leer afhankelijke synaptische plasticiteit over neuronen nodig zijn. De fruitvlieg Drosophila melanogaster vertegenwoordigt een bijzonder gunstig modelorganisme om neuronale circuits onderliggende leren te bestuderen. Het protocol hier gepresenteerd toont een manier waarop de processen die aan de vorming van associatieve reuk geheugens, dat wil zeggen, synaptische activiteit en hun veranderingen, kunnen worden gemonitord in vivo. Met behulp van de brede waaier van genetische hulpmiddelen die beschikbaar zijn in Drosophila, is het mogelijk om genetisch gecodeerde calcium indicatoren expliciet uit te drukken in bepaalde celpopulaties en zelfs enkelvoudige cellen. Door het bevestigen van een vlieg op zijn plaats, en het openen van de hoofd capsule, is het mogelijk om de calcium dynamica in deze cellen te visualiseren terwijl olfactorische stimuli worden gegeven. Daarnaast demonstreren we een set-up waarin de vlieg gelijktijdig kan worden blootgesteld aan elektrische schokken aan het lichaam. Dit biedt een systeem waarin vliegen klassieke olfactorische conditionering kan ondergaan-waarbij een eerder naïeve geur wordt geleerd te worden geassocieerd met elektrische schok straf-op hetzelfde moment als de representatie van deze geur (en andere ongetrainde geuren) is waargenomen in de hersenen via twee-photon microscopie. Ons laboratorium heeft eerder de generatie van Synaptisch gelokaliseerde calcium sensoren gerapporteerd, waardoor men de fluorescerende calcium signalen kan beperken tot pre-of postsynaptische compartimenten. Two-photon microscopie biedt een manier om ruimtelijke structuren op te lossen. We illustreren dit door te focussen op neuronen die informatie van het paddestoel lichaam integreren, een hoger-orde centrum van het insecten brein. Over het algemeen, dit protocol biedt een methode voor het onderzoeken van de synaptische verbindingen tussen neuronen waarvan de activiteit wordt gemoduleerd als gevolg van reuk leren.
Ontcijferen waar en hoe de informatie wordt verworven in de hersenen door te leren en vervolgens opgeslagen als geheugen vormt een van de meest uitdagende taken in neurowetenschappen1. Neurowetenschappelijk onderzoek heeft geleid tot het concept van een verandering in de synaptische transmissie als de neuronale substraat dat ten grondslag ligt aan leren en Geheugenvorming2,3. Het is veronderstelde dat, tijdens het leren, synaptische verbindingen tussen neuronale ensembles die actief zijn tijdens de perceptie van een stimulus zodanig worden gewijzigd dat hun gecombineerde activiteit patroon kan worden opgehaald tijdens geheugen terugroepen, waardoor het instrueren toekomstige gedrags actie4. Deze “engram cellen” en hun synapsen zijn vaak verdeeld over hersengebieden en niveaus van verwerking, waardoor het moeilijk is om waargenomen veranderingen in synaptische transmissie toe te wijzen aan het leren van een taak of een stimulus. Om te lokaliseren en visualiseren van die synaptische veranderingen die causaal gekoppeld aan een specifieke leer taak men moet een juiste modelsysteem dat het mogelijk maakt voor het nauwkeurig beperken van die synapsen.
Voor een dergelijke inspanning is Drosophila melanogaster bijzonder geschikt omdat het relatieve hersen eenvoud, gedrags rijkdom en experimentele toegankelijkheid combineert. Onder de gevestigde model organismen, Drosophila is gelegen tussen de nematode C. elegans en genetisch Tractable zoogdieren zoals muizen in termen van neuronale complexiteit. Het type aantal neuronen (~ 300) en het beperkte gedrags repertoire wordt waargenomen bij C. elegans. Zoogdieren, aan de andere kant, hebben miljoenen neuronen en duizelingwekkende gedrags complexiteit. De hersenen van de fruitvlieg is, met zijn ~ 100.000, neuronen aanzienlijk kleiner dan de hersenen van de meeste gewervelde dieren, en veel van de neuronen zijn individueel identificeerbaar5. Toch toont Drosophila een breed spectrum van complexe gedragingen, waaronder een vermogen om robuuste associatieve olfactorische leer-en Geheugenvorming te vertonen, die voor het eerst werd beschreven 40 jaar geleden6. In de loop van deze klassieke conditionerings procedure worden groepen vliegen onderworpen aan een geur als de geconditioneerde stimulus (CS+) terwijl ze een punierende elektrische schok krijgen als de ongeconditioneerde STIMULUS (VS). Een tweede geur (CS–) wordt dan gepresenteerd zonder straf. Daardoor leren de dieren om de geur geassocieerd met de straf te vermijden, die kan worden getest in een latere keuze situatie tussen de twee geuren, CS+ en CS–. Werk aan het ontleden van de neuronale substraat onderliggende dit gedrag in Drosophila heeft de paddestoel lichamen geïdentificeerd (MB) als de primaire site van de “engram”7,8,9,10 en daarom, de circuits van dit hersengebied was en is het onderwerp van intens onderzoek om de logica te achterhalen waarmee een geheugen-engram wordt verworven en opgeslagen (onlangs beoordeeld in11,12).
De Drosophila MB bestaat uit ~ 2.000 intrinsieke neuronen (Kenyon cellen) per halfrond, georganiseerd in parallelle axonale projecties13. Axonen van olfactorische projectie neuronen worden uitgebreid naar de laterale protocerebra en naar de MB calyces, de belangrijkste dendritische ingangs plaats van de MB en ontvangen olfactorische input van antennal lobben. De lange, parallelle axonen-bundel van Kenyon-cellen vormen de bloem en de lobben. De meeste Kenyon-cellen vormen horizontale β/β’-lobben door een onderpand uit te breiden naar de middenlijn van de hersenen, en de verticale α/α’-lobben door het uitbreiden van tweede onderpand dat projecteren in de dorsale-anterieure richting. De andere groep van Kenyon cellen vormt de horizontale γ-lobben13 van de MB waar het leerproces en de daaropvolgende korte-termijn Geheugenvorming zou kunnen worden gelokaliseerd10. De MB-lobben krijgen een afferente input en zorgen voor een efferente output, die beide meestal beperkt zijn tot verschillende compartimentele subregio’s langs de Kenyon Cell axonen14,15,16. In het bijzonder is aangetoond dat de afferente Dopaminerge MB-input neuronen bemiddel op waarde gebaseerde, bijvoorbeeld, punitieve, versterkende effecten in associatieve reuk Learning15,17. Stereotypic en individueel identificeerbare efferente MB-output neuronen uit de paddestoel Body lobben integreren informatie over grote aantallen Kenyon cellen, richten diverse hersengebieden en dragen gedrag-leerzame eetlust of aversieve informatie15 . Deze neuronale architectuur heeft geleid tot een concept van de organisatie van het associatieve engram. Geuren zijn relatief nauwkeurig gecodeerd door dun geactiveerde ensembles van Kenyon-cellen. De samenvallen activiteit van deze Kenyon celensembles en het vrijkomen van dopamine-opgeroepen door het straffen van stimuli-moduleert transmissie van Kenyon Cell presynapses op MB uitgangs neuronen zodanig dat de dieren vervolgens deze bijzondere geur zal vermijden10 ,12. We gebruiken dit nogal nauwkeurig gedefinieerde en gelokaliseerde engram als een paradigmatische zaak om te illustreren hoe deze leer afhankelijke veranderingen in synaptische activiteit kunnen worden bepaald en gemonitord.
De waarde van Drosophila als modelsysteem is sterk afhankelijk van de ongeëvenaarde genetische Toolbox die het mogelijk maakt om transgenen te uiten voor het identificeren, bewaken en beheersen van enkele neuronen binnen complexe circuits18. De opkomst van technieken voor Neuronale activiteit monitoring-zoals calcium Imaging, hier besproken-hebben toegestaan voor de bepaling van de neuronale activiteit patronen in reactie op een specifieke stimulans. Door het combineren van specifieke Gal4-driven expressie van genetisch gecodeerde calcium indicatoren (GECIs) met olfactorische stimulatie, kan men visualiseren de geur-opgeroepen calcium dynamiek van neuronen van belang19. In dit protocol wordt aangetoond dat door deze techniek verder te koppelen aan een klassiek conditionerings paradigma, het mogelijk is om deze olfactorische responsen in de context van leren te onderzoeken. Leer-geïnduceerde plasticiteit kan verder worden ontleed met behulp van GECIs die niet alleen gelokaliseerd zijn op één specifiek neuron, maar ook op specifieke subcompartimenten van een neuron. Pech et al.20 heeft een selectie van tools opgezet die dit precies mogelijk maken. Door zich te richten op GCaMP321 op de pre-of postsynapse-via-koppeling naar het gewervelde Syntophysin of dHomer, respectievelijk20-de differentiële modulatie van deze sites kan worden onderscheiden. Deze lokalisatie verleent in dit verband een voordeel ten opzichte van de meeste GECIs die alomtegenwoordig aanwezig zijn in de cytosol-bijvoorbeeld GCaMP22, GCaMP321of GCaMP623 -omdat dit betekent dat pre-en postsynaptische transiënten kunnen worden onderscheiden van de totale geïntegreerde calcium instroom die optreedt als gevolg van neuron activatie. Dit kan aanwijzingen geven over de locatie en de soorten plasticiteit die optreden als gevolg van of die leiden tot leren en Geheugenvorming. Als voorbeeld toont het protocol dat hier wordt geleverd de waarde van dit hulpmiddel bij het ontcijferen van de modulatie van MB-uitgangs neuronen tijdens olfactorische associatief leren door de expressie van de calcium sensor te richten op alleen de postsynapse. Door te monitoren, binnen een individuele vlieg, geur-Evoked activiteit voor en na olfactorische conditionering een directe vergelijking kan worden getrokken tussen een naïeve geur respons en een geleerde geur respons. Terwijl ze in dezelfde Imaging kamer zijn bevestigd, worden vliegen blootgesteld aan een selectie van geuren. Vervolgens krijgen ze een aversief associatief conditionerings protocol waarin een van deze geuren is gekoppeld aan elektrische schokken (de CS+) en een andere geur wordt gepresenteerd zonder versterking (de CS–). Ten slotte worden de vliegen weer blootgesteld aan dezelfde geuren als in de eerste stap. Calcium dynamica wordt waargenomen met behulp van twee-photon microscopie.
De dissectie van de neurale circuits onderliggende leren en geheugen is een prominente doel op het gebied van de neurowetenschappen. De genetische bereikbaarheid van Drosophila en de breedte en het gemak van gedragstesten maken dit een ideaal instrument om dergelijke verschijnselen te onderzoeken. Hier wordt een methode gepresenteerd waarmee het mogelijk is om binnen individuele vliegen de modulatie te visualiseren die optreedt op een subcellulair niveau als gevolg van olfactorische conditionering. Door het uitv…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door de Duitse Onderzoeksraad via het collaboratief onderzoekscentrum SFB 889 “mechanismen van sensorische verwerking” en de onderzoekseenheid voor 2705 “dissectie van een hersen circuit: structuur, plasticiteit en Gedragsfunctie van de Drosophila paddestoel lichaam “.
1-Octen-3-ol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | O5284 | Chemical used as odorant |
3-Octanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 218405 | Chemical used as odorant |
4-Methylcyclohexanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 153095 | Chemical used as odorant |
Bandpass filter for EGFP (525/50 nm) | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany | ||
Clear adhesive tape | Tesa SE, Norderstedt, Germany | Standard claer adhesive tape | |
Concave-convex jaws | Fine Science Tools, North Vancouver, Canada | 10053-09 | Blade Holders with concave-convex jaws |
Fine forceps | Fine Science Tools, North Vancouver, Canada | 11412-11 | Forceps with tip 0.1 x 0.06mm |
Hypodermic needle | Sterican – B. Braun, Melsungenk, Germany | 4665120 | 1.20x40mm |
Insect Minutien pins | Fine Science Tools, North Vancouver, Canada | 26002-10 | Diameter 0.1mm, tip 0.0125mm |
Kentoflow | Kent Express Dental Supplies, Gillingham, UK | 953683 | Blue light-curing glue |
Microscope slide | Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany | 0656.1 | Standard objective slide 76 x 26 mm |
Mineral oil | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | M8410 | Used as diluent for odorants |
Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2 | Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA | Tunable infrared femtosecond laser | |
Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany | Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices. | |
Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany | 421452-9900-000 | Objective W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm |
Ringer's solution | n.a. | n.a. | 5mM KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM sucrose, pH = 7.4 |
Stab knife | Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA | 72-1551 | 5.0mm Straight restricted blade depth |
Surgical scalpel blade | Swann-Morton, Sheffield, UK | 0303 | Product No. 11 |
Surgical scalpel handle | Swann-Morton, Sheffield, UK | 0907 | Product No. 7S/S |
Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger from the odor-delivery device and the electric shock application device (power supply) to interact with the ZEN software from Zeiss that controls the microscope. |
Custom-written and available upon request | n.a. | n.a. |