In Vivo Optische Calcium-Bildgebung der lerninduzierten synaptischen Plastizität bei Drosophila melanogaster

Die Entschlüsselung, wo und wie die Informationen durch Lernen im Gehirn erfasst und anschließend als Gedächtnis gespeichert werden, stellt eine der schwierigsten Aufgaben in der Neurowissenschaft¹dar. Neurowissenschaftliche Forschung hat zum Konzept einer Veränderung der synaptischen Übertragung als neuronales Substrat geführt, das dem Lernen und der Gedächtnisbildung zugrunde liegt^2,3. Es wird vermutet, dass während des Lernens synaptische Verbindungen zwischen neuronalen Ensembles, die während der Wahrnehmung eines Stimulus aktiv sind, so verändert werden, dass ihr kombiniertes Aktivitätsmuster während des Gedächtnisabrufs abgerufen werden kann, wodurch zukünftige Verhaltensaktion⁴. Diese “Engrammzellen” und ihre Synapsen sind oft über Hirnregionen und Verarbeitungsebenen verteilt, was es schwierig macht, beobachtete Veränderungen in der synaptischen Übertragung dem Erlernen einer Aufgabe oder eines Stimulus zuzuordnen. Um die synaptischen Veränderungen zu lokalisieren und zu visualisieren, die kausal mit einer bestimmten Lernaufgabe verbunden sind, braucht man ein geeignetes Modellsystem, das es ermöglicht, diese Synapsen präzise einzubeschränken.

Für ein solches Unterfangen eignet sich Drosophila melanogaster besonders, weil es relative Einfachheit des Gehirns, Verhaltensreichtum und experimentelle Zugänglichkeit kombiniert. Unter den etablierten Modellorganismen liegt Drosophila zwischen dem Nematoden C. elegans und genetisch beweglichen Säugetieren wie Mäusen in Bezug auf die neuronale Komplexität. Die stereotype Anzahl der Neuronen (300) und das begrenzte Verhaltensrepertoire werden in C. elegansbeobachtet. Säugetiere hingegen haben Millionen von Neuronen und eine erstaunliche Verhaltenskomplexität. Das Gehirn der Fruchtfliege ist mit seinen 100.000 Us-Litern deutlich kleiner als die Gehirne der meisten Wirbeltiere, und viele der Neuronen sind individuell identifizierbar⁵. Dennoch zeigt Drosophila ein breites Spektrum komplexer Verhaltensweisen, einschließlich der Fähigkeit, robustes assoziatives olfaktorisches Lernen und Gedächtnisbildung zu zeigen, das erstmals vor über 40 Jahren beschrieben wurde⁶. Im Rahmen dieses klassischen Konditionierungsverfahrens werden Fliegengruppen einem Geruch als konditionierter Stimulus (CS⁺) ausgesetzt, während sie einen strafenden Elektrischen Schlag als den unkonditionierten Stimulus (US) erhalten. Ein zweiter Geruch (CS^–) wird dann ohne Strafe präsentiert. Dabei lernen die Tiere, den mit der Bestrafung verbundenen Geruch zu vermeiden, der in einer späteren Wahlsituation zwischen den beiden Gerüchen CS⁺ und CS^–getestet werden kann. Die Arbeit an der Sezieren des neuronalen Substrats, das diesem Verhalten in Drosophila zugrunde liegt, hat die Pilzkörper (MB) als primäre Stelle des “Engramms” identifiziert^7,8,9,10 und daher war und ist die Schaltung dieser Hirnregion Gegenstand intensiver Forschung, um die Logik aufzudecken, durch die ein Speicherengramm erworben und gespeichert wird (vor kurzem in^11,12überprüft).

Die Drosophila MB besteht aus 2.000 intrinsischen Neuronen (Kenyon-Zellen) pro Hemisphäre, organisiert in parallelen axonalen Projektionen¹³. Axone von olfaktorischen Projektionsneuronen werden auf die seitliche Protocerebra und auf die MB-Calyces, die Haupt-dendritische Eingangsstelle des MB, ausgedehnt und empfangen olfaktorische Eingaben von Antennenlappen. Das lange, parallele Axonbündel von Kenyon-Zellen bilden den Pedunkel und die Lappen. Die meisten Kenyon-Zellen bifurcate bilden horizontale ,-Lappen, indem sie eine Sicherheit in Richtung der Mittellinie des Gehirns ausdehnen, und die vertikalen ,,/”-Lappen, indem sie die zweite Sicherheit erweitern, die in die dorsale Vorderrichtung projiziert. Die andere Gruppe von Kenyon-Zellen bildet die horizontalen -lappes¹³ des MB, wo der Lernprozess und die anschließende Kurzzeitgedächtnisbildung lokalisiert werden könnten¹⁰. Die MB-Lappen erhalten eine affete Eingabe und bieten eine efferente Ausgabe, die beide in der Regel auf unterschiedliche Teilunterregionen entlang der Kenyon-Zell-Axone^14,15,16beschränkt sind. Insbesondere haben afferente dopaminerge MB-Eingangsneuronen gezeigt, dass sie wertbasierte, z.B. strafbare, verstärkende Effekte im assoziativen olfaktorischen Lernen^15,17vermitteln. Stereotypische und individuell identifizierbare effelösenMB Output-Neuronen aus den Pilzkörperlappen integrieren Informationen über eine große Anzahl von Kenyon-Zellen, zielen auf verschiedene Hirnbereiche ab und tragen verhaltens-lehrreiche appetitive oder aversive Informationen¹⁵ . Diese neuronale Architektur hat zu einem Konzept der Organisation des assoziativen Engramms geführt. Gerüche werden relativ präzise von spärlich aktivierten Ensembles von Kenyon-Zellen kodiert. Die zufällige Aktivität dieser Kenyon-Zell-Ensembles und die Freisetzung von Dopamin – evoziert durch strafende Reize – moduliert die Übertragung von Kenyon-Zell-Präsynapsen auf MB-Ausgangsneuronen, so dass die Tiere anschließend diesen besonderen Geruch vermeiden^{10 ,12}. Wir verwenden dieses ziemlich genau definierte und lokalisierte Engramm als paradigmatischen Fall, um zu veranschaulichen, wie diese lernabhängigen Veränderungen der synaptischen Aktivität bestimmt und überwacht werden können.

Der Wert von Drosophila als Modellsystem hängt stark von der unübertroffenen genetischen Toolbox ab, die es ermöglicht, Transgene zur Identifizierung, Überwachung und Steuerung einzelner Neuronen innerhalb komplexer Schaltkreise auszudrücken¹⁸. Das Aufkommen von Techniken zur neuronalen Aktivitätsüberwachung – wie die hier diskutierte Kalzium-Bildgebung – hat die Bestimmung neuronaler Aktivitätsmuster als Reaktion auf einen bestimmten Reiz ermöglicht. Durch die Kombination spezifischer Gal4-gesteuerter Expression genetisch kodierter Calciumindikatoren (GECIs) mit olfaktorischer Stimulation kann man die geruchsbeschworene Kalziumdynamik von Neuronen von Interesse visualisieren¹⁹. In diesem Protokoll wird gezeigt, dass es durch die weitere Kopplung dieser Technik mit einem klassischen Konditionierungsparadigma möglich ist, diese olfaktorischen Reaktionen im Kontext des Lernens zu untersuchen. Lerninduzierte Plastizität kann mit GECIs weiter seziert werden, die nicht nur auf ein einzelnes spezifisches Neuron, sondern auch auf bestimmte Teilabteilungen eines Neurons lokalisiert sind. Pech et al.²⁰ haben eine Auswahl an Werkzeugen etabliert, die genau dies erlauben. Durch die Ausrichtung von GCaMP3²¹ auf die Vor- oder Postsynapse – über die Verbindung zum Wirbeltier Synaptophysin bzw. dHomer bzw.²⁰– kann die Differentialmodulation dieser Standorte unterschieden werden. Diese Lokalisierung verschafft in diesem Zusammenhang einen Vorteil gegenüber den meisten GECIs, die im gesamten Zytosol allgegenwärtig sind – z. B. GCaMP²², GCaMP3²¹oder GCaMP6²³ -, da es bedeutet, dass prä- und postsynaptische Transienten vom gesamten integrierten Kalziumzufluss, der durch neuronische Aktivierung auftritt, unterschieden. Dies kann Hinweise auf den Ort und die Arten der Plastizität geben, die als Folge von oder zu Lern- und Gedächtnisbildung auftreten. Als Beispiel zeigt das hier bereitgestellte Protokoll den Wert dieses Werkzeugs bei der Entschlüsselung der Modulation von MB-Ausgangsneuronen während des olfaktorischen assoziativen Lernens, indem es die Expression des Kalziumsensors nur auf die Postsynapse ausrichtet. Durch die Überwachung, innerhalb einer einzelnen Fliege, geruchsevokte Aktivität vor und nach der Geruchskonditionierung kann ein direkter Vergleich zwischen einer naiven Geruchsreaktion und einer erlernten Geruchsreaktion gezogen werden. Während sie in derselben Bildkammer fixiert sind, werden Fliegen einer Auswahl von Gerüchen ausgesetzt. Dann erhalten sie ein aversives assoziatives Konditionierungsprotokoll, in dem einer dieser Gerüche mit einem elektrischen Schlag gepaart wird (wird das CS⁺) und ein weiterer Geruch wird ohne Verstärkung präsentiert (wird zum CS^–). Schließlich sind die Fliegen wieder den gleichen Gerüchen ausgesetzt wie im ersten Schritt. Die Calciumdynamik wird mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie beobachtet.