Drosophila melanogaster Öğrenme Kaynaklı Sinaptik Plastisite Vivo Optik Kalsiyum Görüntüleme

Bilginin öğrenme yoluyla beyinde nereden ve nasıl elde edildiği ve daha sonra bellek olarak depolandığı deşifre etmek, nörolojinin en zorlu görevlerinden birini oluşturmaktadır^1. Nörobilimsel araştırma öğrenme ve hafıza oluşumu 2 altında yatan nöronal substrat olarak sinaptik iletim bir değişiklik kavramına yol açmıştır^2,3. Öğrenme sırasında, bir uyarıcının algılanması sırasında aktif olan nöronal topluluklar arasındaki sinaptik bağlantıların, bir leştirilmiş aktivite deseni hafıza hatırlama sırasında alınabilecek şekilde değiştirilebileceği ve bu nedenle gelecekteki davranışsal eylem⁴. Bu “engram hücreleri” ve onların sinapsları genellikle beyin bölgeleri ve işleme düzeyleri arasında dağıtılır, hangi zor bir görev veya uyarıcı öğrenme sinaptik iletim gözlenen değişiklikler atamak için yapar. Belirli bir öğrenme görevine nedensel olarak bağlı olan bu sinaptik değişiklikleri yerelleştirmek ve görselleştirmek için, bu sinapsların tam olarak sınırlandırılmasına olanak tanıyan uygun bir model sistemine ihtiyaç vardır.

Böyle bir çaba için, Drosophila melanogaster göreceli beyin basitliği, davranışsal zenginlik ve deneysel erişilebilirlik birleştirir çünkü özellikle uygundur. Köklü model organizmalar arasında, Drosophila nöronal karmaşıklık açısından fareler gibi nematod C. elegans ve genetik olarak çekilebilir memeliler arasında yer almaktadır. C. elegans’tastereotipik nöron sayısı (~300) ve sınırlı davranışsal repertoi gözlenir. Memelilerin ise milyonlarca nörona ve şaşırtıcı davranış sallabına sahiptir. Meyve sineğinin beyni, ~100.000’i ile, çoğu omurgalının beyninden önemli ölçüde daha küçük nöronlardır ve nöronların çoğu tek tek tanımlanabilir^5. Ancak, Drosophila karmaşık davranışlarıgeniş bir yelpazede göstermek, sağlam bir bağdaştırıcı koku öğrenme ve hafıza oluşumu sergilemek için bir yetenek de dahil olmak üzere, ilk üzerinde açıklanan⁴⁰yıl önce 6 . Bu klasik koşullandırma prosedürü sırasında, sinek grupları koşullu uyarıcı (CS⁺) olarak bir kokuya maruz kalırken, koşulsuz uyarıcı (ABD) olarak cezalandırıcı bir elektrik şoku alırlar. İkinci bir koku (CS^–) sonra herhangi bir ceza olmadan sunulmaktadır. Bu nedenle, hayvanlar iki koku, CS⁺ ve CS arasında bir sonraki seçim durumunda test edilebilir ceza ile ilişkili koku önlemek için öğrenirler^–. Drosophila bu davranışın altında yatan nöronal substrat diseksiyon çalışmaları mantar organları (MB) “engram”^{7,8,9,10 birincil site olarak belirlemiştir} ve, bu nedenle, bu beyin bölgesinin devre ve bir bellek engram elde edilir ve saklanır mantığı ortaya çıkarmak için yoğun araştırma konusudur (son zamanlarda gözden^11,12).

Drosophila MB oluşur ~ 2,000 içsel nöronlar (Kenyon hücreleri) yarımküre başına, paralel aksonal projeksiyonlar düzenlenen¹³. Koku projeksiyon nöronların aksonlar lateral protocerebra ve MB calyces, MB ana dendritik giriş sitesi ve anten lobları koku girişi almak uzatılır. Kenyon hücrelerinin uzun, paralel aksonlar demeti peduncle ve loblar oluşturmaktadır. Kenyon hücrelerinin çoğu, bir teminatı beynin orta çizgisine, dikey α/α’-lobları ise dorsal-anterior yönde ikinci kollateral projektifi genişleterek yatay β/β’-loblar oluşturur. Kenyon hücrelerinin diğer grup öğrenme süreci ve sonraki kısa süreli bellek oluşumu lokalize olabilir MB yatay γ-loblar¹³ oluşturur¹⁰. MB loblar afferent giriş almak ve efferent çıkış sağlamak, her ikisi de genellikle Kenyon hücre aksonları boyunca farklı bölümalt bölgeleri ile sınırlıdır^14,15,16. Özellikle, afferent dopaminerjik MB giriş nöronların, örneğin, cezalandırıcı, uyarıcı koku öğrenme etkileri takviye değer tabanlı aracılık gösterilmiştir^15,17. Mantar vücut loblarından stereotipik ve bireysel olarak tanımlanabilir efferent MB çıkış nöronlar Kenyon hücrelerinin çok sayıda arasında bilgi entegre, hedef çeşitli beyin alanları ve ayı davranış-öğretici iştah açıcı veya aversive bilgi¹⁵ . Bu nöronal mimari assosiyatif engram organizasyonu bir kavram yol açmıştır. Kokular nispeten hassas Kenyon hücrelerinin seyrek aktive topluluklar tarafından kodlanır. Bu Kenyon hücre topluluklarının tesadüfi aktivitesi ve dopamin salınımı – uyarıcıları cezalandırarak uyarılmış – Kenyon hücre presynapses mb çıkış nöronlar üzerine bulaşma modüle böylece hayvanlar daha sonra bu özel koku önlemek olacaktır^{10 ,12}. Bu tam olarak tanımlanmış ve lokalize engramı, sinaptik aktivitedeki bu öğrenmeye bağımlı değişikliklerin nasıl belirlenip izlenebileceğini göstermek için paradigmatik bir olgu olarak kullanırız.

Bir model sistemi olarak Drosophila değeri güçlü bir tanımlamak için transgenler ifade sağlar eşsiz genetik araç kutusu dayanır, izleme, ve karmaşık devreler içinde tek nöronlar kontrol¹⁸. Nöronal aktivite izleme teknikleri gelişiyle – kalsiyum görüntüleme gibi, burada tartışılan – belirli bir uyarıcı yanıt olarak nöronal aktivite kalıplarının belirlenmesi için izin verdi. Genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerinin (GECIs) spesifik Gal4 güdümlü ifadesini koku stimülasyonu ile birleştirerek, ilgi nöronların koku uyandıran kalsiyum dinamiklerini görselleştirebilirsiniz¹⁹. Bu protokolde, bu tekniği klasik koşullandırma paradigması ile daha fazla bağlayarak, bu koku alma yanıtlarını öğrenme bağlamında incelemenin mümkün olduğu gösterilmiştir. Öğrenme kaynaklı plastisite sadece tek bir spesifik nörona lokalize değil, aynı zamanda bir nöronun belirli alt bölümlerine gecis kullanılarak daha da kesilebilir. Pech ve ark.²⁰ tam olarak bu izin araçları bir seçim kurdu. GCaMP3^21’i, omurgalı Synaptophysin veya dHomer’a bağlantı yoluyla, sırasıyla^20-ön veya postsynapse’ye hedefleyerek, bu sitelerin diferansiyel modülasyonu ayırt edilebilir. Bu yerelleştirme, bu bağlamda, sitosol boyunca her yerde mevcut olan çoğu GECIs üzerinde bir avantaj confers – örneğin, GCaMP²², GCaMP3²¹, veya GCaMP6²³ – bu önceden ve postsynaptic geçici olabilir anlamına gelir çünkü nöron aktivasyonu sonucu oluşan genel entegre kalsiyum akını ayırt. Bu, öğrenme ve hafıza oluşumuna neden olan veya bunun sonucu olarak ortaya çıkan plastisitenin konumu ve türleri hakkında ipuçları sağlayabilir. Örnek olarak, burada sağlanan protokol, kalsiyum sensörünün ekspresyonunu sadece postsynapse’ye doğru hedefleyerek koku alma sırasında MB çıkış nöronların modülasyonunu çözmede bu aracın değerini göstermektedir. İzleyerek, tek bir sinek içinde, koku kondisyon öncesi ve sonrası koku uyarılmış aktivite naif bir koku tepkisi ve öğrenilen bir koku tepkisi arasında doğrudan bir karşılaştırma çizilebilir. Aynı görüntüleme odasında sabit iken, sinekkokular bir seçim maruz kalır. Daha sonra, bu kokulardan birinin elektrik şokuyla eşleştirilmiş olduğu (CS⁺olma) ve başka bir kokunun takviye olmadan sunulduğu (CS^{olma – )}bir önleyici bağdaştırıcı koşullandırma protokolü alırlar. Son olarak, sinekler yine ilk adımda olduğu gibi aynı kokulara maruz kalırlar. Kalsiyum dinamiği iki foton mikroskopi ile gözlenir.