In Vivo Optical Calcium Imaging della plasticità sinaptica indotta dall'apprendimento in Drosophila melanogaster

Decifrare dove e come le informazioni vengono acquisite nel cervello attraverso l’apprendimento e successivamente memorizzate come memoria costituisce uno dei compiti più impegnativi nelle neuroscienze¹. La ricerca neuroscientifica ha portato al concetto di un cambiamento nella trasmissione sinaptica come substrato neuronale che sta alla base dell’apprendimento e della formazione della memoria^2,3. Si ipotizza che, durante l’apprendimento, le connessioni sinaptiche tra insiemi neuronali attivi durante la percezione di uno stimolo si modificano in modo tale che il loro modello di attività combinata può essere recuperato durante il richiamo della memoria, istruendo così azione comportamentale futura⁴. Queste “cellule engramma” e le loro sinapsi sono spesso distribuite tra le regioni del cervello e livelli di elaborazione, il che rende difficile assegnare i cambiamenti osservati nella trasmissione sinaptica all’apprendimento di un compito o di uno stimolo. Per localizzare e visualizzare i cambiamenti sinaptici che sono causalmente legati a una specifica attività di apprendimento è necessario un sistema modello appropriato che permetta di confinare con precisione quelle sinapsi.

Per un tale sforzo, La Drosophila melanogaster è particolarmente adatta perché combina relativa semplicità del cervello, ricchezza comportamentale e accessibilità sperimentale. Tra gli organismi modello ben consolidati, la Drosophila si trova tra il nematode C. elegans e mammiferi geneticamente trattabili come i topi in termini di complessità neuronale. Il numero stereotipato di neuroni (300 dollari) e repertorio comportamentale limitato è osservato in C. elegans. I mammiferi, d’altra parte, hanno milioni di neuroni e una complessità comportamentale impressionante. Il cervello della mosca della frutta è, con i suoi 100.000 dollari, neuroni significativamente più piccoli del cervello della maggior parte dei vertebrati, e molti dei neuroni sono individualmente identificabili⁵. Eppure, la Drosophila dimostra un ampio spettro di comportamenti complessi, tra cui la capacità di esibire robusto apprendimento olfattivo associativo e formazione della memoria, descritto per la prima volta oltre 40 anni fa⁶. Nel corso di questa classica procedura di condizionamento, gruppi di mosche sono soggetti a un odore come stimolo condizionato^(CS) mentre ricevono una scossa elettrica punitiva come stimolo incondizionato (US). Un secondo odore (CS^–) viene quindi presentato senza alcuna punizione. Di conseguenza, gli animali imparano ad evitare l’odore associato alla punizione, che può essere testato in una successiva situazione di scelta tra i due odori, CS^e CS^–. Il lavoro sulla sezionata del substrato neuronale alla base di questo comportamento nella Drosophila ha identificato i corpi fungini (MB) come sito primario dell'”engramma”^7,8,9,10 e, quindi, il circuito di questa regione del cervello è stato ed è oggetto di intensa ricerca al fine di scoprire la logica con cui un engramma di memoria viene acquisito e memorizzato (recentemente rivisto in^11,12).

Il MB di Drosophila è costituito da 2.000 neuroni intrinseci (cellule Kenyon) per emisfero, organizzati in proiezioni assonali parallele¹³. Gli assoni dei neuroni di proiezione olfattiva sono estesi alla protocerebra laterale e ai calyces MB, il principale sito di input dendritico del MB e ricevono input olfattivo dai lobi delle antenne. Il lungo fascio parallelo di assoni di cellule Kenyon costituisce il peduncolo e i lobi. La maggior parte delle cellule di Kenyon biforcate che formano lobi orizzontali di z/z’-lobi estendendo una garanzia verso la linea mediana del cervello, e i lobi verticali di zz’—lobe estendendo la seconda proiezione collaterale nella direzione dorsale-anteriore. L’altro gruppo di cellule Kenyon forma i lobi orizzontali¹³ del MB in cui il processo di apprendimento e la successiva formazione di memoria a breve termine potrebbero essere localizzati¹⁰. I lobi MB ricevono input afferente e forniscono un output efferente, entrambi in genere limitati a sottoregioni compartitali distinte lungo gli assoni della cella Kenyon^14,15,16. In particolare, i neuroni di input dopaminergici MB afferenti hanno dimostrato di mediare gli effetti di valore, ad esempio punitivi, rafforzanti nell’apprendimento olfattivo associativo^15,17. Stereotipica e singolarmente identificabili neuroni di uscita MB efferente dai lobi del corpo del fungo integrano le informazioni attraverso un gran numero di cellule Kenyon, prendono di mira diverse aree cerebrali e orso comportamento-istruttivo appetitive o informazioni avverse¹⁵ . Questa architettura neuronale ha portato ad un concetto di organizzazione dell’engramma associativo. Gli odori sono codificati relativamente precisamente da insiemi scarsamente attivati di cellule Kenyon. L’attività coincidente di questi insiemi di cellule Kenyon e il rilascio di dopamina – evocati da stimoli punitivi – modula la trasmissione dai presynapsi delle cellule Kenyon su neuroni di uscita MB in modo tale che gli animali eviteranno successivamente questo particolare odore^{10 ,12}. Usiamo questo engramma piuttosto definito e localizzato come un caso paradigmatico per illustrare come questi cambiamenti dipendenti dall’apprendimento nell’attività sinaptica possono essere determinati e monitorati.

Il valore della Drosophila come sistema modello si basa fortemente sulla cassetta degli attrezzi genetica senza pari che permette di esprimere transgeni per identificare, monitorare e controllare singoli neuroni all’interno di circuiti complessi¹⁸. L’avvento di tecniche per il monitoraggio dell’attività neuronale – come l’imaging del calcio, discusso qui – ha permesso la determinazione dei modelli di attività neuronale in risposta a uno stimolo specifico. Combinando l’espressione specifica guidata da Gal4 di indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI) con la stimolazione olfattiva, si può visualizzare la dinamica di calcio evocata dagli odori dei neuroni di interesse¹⁹. In questo protocollo, è dimostrato che accolando ulteriormente questa tecnica con un paradigma di condizionamento classico, è possibile esaminare queste risposte olfattive nel contesto dell’apprendimento. La plasticità indotta dall’apprendimento può essere ulteriormente sezionata utilizzando GECI che non solo sono localizzate in un singolo neurone specifico, ma anche a specifici sottocomparti di un neurone. Pech et al.²⁰ ha stabilito una selezione di strumenti che consentono esattamente questo. Mirando a GCaMP3²¹ al pre o al postynapse – tramite collegamento con il vertebrato Synaptophysin o dHomer, rispettivamente²⁰– la modulazione differenziale di questi siti può essere distinta. Questa localizzazione conferisce, in questo contesto, un vantaggio rispetto alla maggior parte delle GECI che sono onnipresenti presenti in tutto il citosol – ad esempio, GCaMP²², GCaMP3²¹, o GCaMP6²³ – perché significa che i transitori pre e post-naptici possono essere distinto dall’afflusso complessivo di calcio integrato che si verifica a seguito dell’attivazione del neurone. Questo può fornire indizi circa la posizione e tipi di plasticità che si verificano a seguito di o che causano l’apprendimento e la formazione della memoria. Ad esempio, il protocollo qui fornito mostra il valore di questo strumento per decifrare la modulazione dei neuroni di output MB durante l’apprendimento associativo olfattivo prendendo di mira l’espressione del sensore di calcio per solo il post-sinapsi. Monitorando, all’interno di una singola mosca, l’attività evocata dagli odori prima e dopo il condizionamento olfattivo può essere tracciata tra una risposta all’odore ingenua e una risposta all’odore appresa. Mentre fissate nella stessa camera di imaging, le mosche sono esposte a una selezione di odori. Poi, ricevono un protocollo di condizionamento associativo avverso in cui uno di questi odori è accoppiato con scossa elettrica (diventando il CS⁾e un altro odore viene presentato senza rinforzo (diventando il CS^–). Infine, le mosche sono nuovamente esposte agli stessi odori del primo passo. La dinamica del calcio viene osservata mediante microscopia a due fotoni.