GEN1에 의한 홀리데이 정션 분해능의 실시간 조사를 위한 단일 분자 Förster 공명 에너지 전송 방법

1. 표면 기능화 커버립의 준비 클리닝 코플린 항아리 안에 에탄올에 5개의 커버슬립(24mm x 60mm)을 넣습니다. 에탄올에 소닉에 넣고 1 M M 수산화 칼륨을 30 분 동안 3x. 아세톤 3x로 씻은 다음 데틴트에 씻으소서. 실라화 아세톤에 2.8% 3-아미노프로필리에톡실란(APTES)의 용액을 준비한다. APTES 병을 파라핀 필름으로 밀봉하고 4°C에서 보관하십시오.참고: 안전 고글을 사용하고 연기 후드 아래에서 작업하십시오. 일란 용액의 용기는 완전히 건조되고 항아리에 시란 용액을 붓기 직전과 후에 아세톤으로 헹구어야합니다. 2.8% APTES 용액의 70 mL를 커버립을 포함하는 코플린 항아리에 붓습니다. 궤도 셰이커에서 항아리를 4분 간 흔들어 줍니다. 항아리가 5 분 동안 벤치에 서서 1 분 동안 초음파 처리한 다음 마지막으로 실란이 유리 표면의 하이드록실 그룹과 반응할 수 있도록 10 분 동안 벤치에 항아리를 유지하십시오. 신속한 용매 교환을 위해 항아리에 직접 물을 부어 탈이온수 1 L을 첨가하여 반응을 담금질합니다. 평평한 표면에 항아리의 옆으로 흔들어 물에 슬라이드 를 3 배 헹구십시오. 커버슬립을 항아리에서 꺼내 알루미늄 호일 트레이에 놓습니다. 커버슬립을 110°C에서 오븐에 30분간 구워 서 커버슬립을 건조시키고 실란을 경화시립니다. 트레이를 벤치에 두어 커버립을 실온으로 식힙니다. PEGylation 용기를 개봉시 수분의 응축을 방지하기 위해 -20 °C에서 실온 (RT)에 저장 된 생체 용 페그와 PEG를 따뜻하게하십시오. 상자에서 실란화된 표면이 위를 향하여 5개의 덮개 를 놓습니다. 실란화된 커버 슬립의 가장자리를 따라 스페이서로 두 개의 커버 유리 슬립(22mm x 22mm)을 놓습니다. 일단 예열되면, 1mL의 신선한, 0.1 M 나트륨 중탄산염 용액에서 1.5 mg의 생체 티니틸화 된 PEG와 150 mg의 PEG를 1.5 mL 튜브에 추가하여 1mL의 비율로 생체 틸화 된 PEG 및 PEG 용액을 만듭니다. 튜브를 소용돌이로 하여 PEG를 용해시키고 아래로 회전하여 기포를 제거합니다.참고 : PEG가 최소 시간 내에 용액에서 가수 분해되기 때문에이 단계에서 진행하십시오. 각 커버슬립에 PEG 용액 100 μL을 빠르게 바치도록 하십시오. 또 다른 구운 커버 슬립을 가지고 PEG 용액으로 커버 슬립 위에 상단 실란 표면을 향하도록 배치하여 22mm x 22mm 비 실란화 커버립을 허용하는 유리 용액 유리 샌드위치를 형성합니다. 쉽게 분리할 수 있습니다. 커버슬립을 밤새 (16시간) 어둠 속에서 RT에서 배양합니다. 배양이 완료되면, 덮개를 따로 따로 가져 온 다음 분출 병으로 옆에서 씻어 탈이온 수를 사용하여 10 배 헹구십시오. 마른 질소의 흐름 아래 커버립을 건조. 마른 커버슬립을 진공 밑에 보관하십시오.참고: 슬라이드는 품질 저하 없이 1개월 동안 사용할 수 있습니다. 2. 유동 전지의 준비 단일 채널 플로우 셀 석영 슬라이드의 중간 부분에 직경이 1.22mm인 두 개의 구멍을 드릴(50mm x 20mm)의 중앙은 37mm 간격으로, 슬라이드 가장자리에서 6.5mm 떨어져있습니다(그림 1A). 전자 커터를 사용하여 41mm x 2.25mm 채널을 50mm x 20mm 크기의 이중 접착 시트로 잘라냅니다. 보호 커버의 플라스틱 면을 벗기고 조각의 가장자리를 석영 슬라이드의 가장자리와 정렬합니다. 폴리테트라플루오로에틸렌 핀셋으로 가볍게 눌러 갇힌 기포를 제거합니다. 접착제 조각의 용지 쪽을 벗깁니다. 커버슬립의 기능화된 표면에 조각을 장착합니다. 폴리에틸렌 튜브(I.D. 1.22 mm)를 입구의 경우 11cm, 출구의 경우 25cm의 길이로 자른다. 튜브를 유동 셀의 입구 및 출구로 이전에 뚫은 구멍에 삽입합니다. 5분 에폭시 접착제를 사용하여 석영 커버슬립 인터페이스의 가장자리와 입구 및 출구의 튜브 주변을 밀봉합니다. 나중에 사용하기 위해 건조하거나 건조한 진공 아래에 보관한 후 즉시 플로우 셀을 사용하십시오. 0.03 mg/mL의 농도로 PBS에서 아비딘을 용해시. 0.2 μm 주사기 필터를 통해 필터링합니다. 아비딘을 1 mL 주사기를 사용하여 유동 셀로 흐르게 한다. 버퍼로 채워진 다른 주사기를 사용하여 여분의 아비딘을 씻어냅니다. 주사기를 교환하는 동안 기포가 들어가지 않도록 주의하십시오. 다중 채널 흐름 셀 석영 슬라이드의 긴 면(76mm x 25mm)에 직경이 1.22mm인 6개의 구멍을 드릴합니다(그림1B). 슬라이드 가장자리에서 4.5mm, 간격으로 9.3mm 떨어진 구멍을 만듭니다. 각 구멍 쌍의 중심 사이의 거리가 15mm인지 확인합니다. 전자 커터를 사용하여 6개 채널(20mm x 2.25mm)을 76mm x 25mm 이중 접착 테이프로 잘라냅니다. 보호 커버의 플라스틱 면을 벗기고 점착제 조각의 가장자리를 석영 슬라이드의 가장자리와 정렬합니다. 폴리테트라플루오로에틸렌 핀셋을 사용하여 부드럽게 눌러 갇힌 기포를 제거합니다. 접착제 조각의 용지 면을 벗겨 내고 커버슬립의 기능화 된 표면에 장착하십시오.참고: 경우에 따라 용지 면을 벗기고 석영 슬라이드에 부착하는 것이 다채널 흐름 셀에서 잘 작동합니다. 6개 채널에 대한 입구 튜브(11cm)와 출구 튜브(25cm)를 절단합니다. 단계 2.1.6-2.1.9에 설명된 대로 유동 셀을 준비합니다. 첫 번째 채널의 출구를 펌프에 연결합니다. OSS가 있는 0.5 mL 튜브에 입구를 놓습니다.참고: 입구 관의 길이는 효소가 유동 세포로 들어가는 시간을 동기화하고 이미징의 시작을 동기화하여 연속 적인 흐름 하에서 수행된 절단 실험에서 이벤트 수를 최대화하여 조기 광표백을 감소시키기 위해 선택됩니다. 형광소. 사용된 채널의 출구를 분리하여 새 채널로 이동합니다. 플라스틱 부품의 접착제로 밀봉된 주사기 바늘로 만든 플러그로 콘센트를 닫습니다. 사용된 채널의 입구를 닫습니다. 3. 산소 청소 시스템 (OSS)의 준비 메탄올 800 μL에서 0.2 g의 (±)-6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로메-2-카르복실산(플루오로포레의 깜박임을 최소화하는 삼중 상태 퀴시버)을 용해시. 6 mL의 탈이온화 된 H2O를 추가하고 용해 될 때까지 1 N NaOH 드롭 와이즈를 추가하십시오. 주사기 필터를 통해 필터, 1 mL aliquots로 만들고, -80 °C에서 저장합니다. 재고 농도는 ~100 μM입니다. ddH2O의 4 mL에 61 mg의 PCA 분말을 용해시킴으로써 3,4-디옥시벤조산(PCA)의 신선한 용액을 준비합니다. 재고 농도는 ~ 100 nM입니다. 58 μL 의 10 N NaOH 드롭 와이즈를 추가하여 PCA가 완전히 용해 될 때까지 각 방울 후에 소용돌이를 확인하십시오 (pH = 9). 5.3 mg의 프로토카테카테를 3,4-디옥시게나제(3,4-PCD)를 7 mL의 PCD 저장 완충액에 용해시키소서(표 1). 3,4-PCD는 프로토카테츄산34의산화를 촉매하여 결합/절단 완충제에서 산소를 제거합니다. PCD 솔루션을 1mL aliquots로 나눕니다. 재고 농도는 ~1 μM. 액체 질소에 aliquots를 스냅 동결하고 장기 보관을 위해 -80 °C또는 단기 보관을 위해 -20 °C에서 저장합니다. 새 바인딩 버퍼를 준비합니다(표1). smFRET 절단 실험을 위해 2 mM MM MCl2를 2 mM MgCl2로 대체하십시오. 이미징 버퍼의 1 mL를 준비합니다(표1). 산소 청소 시스템의 활성을 유지하기 위해 유동 세포에 도입 될 때까지 얼음에 이미징 버퍼를 유지합니다. 4. 형광 표지 HJs의 준비 트리스-EDTA 완충액에서동구화된 올리고(표2)를100 μM의 농도로 재구성한다. 표 1에열거된 각 X0 올리고의 ~3 μL을 등쪽 부분을 혼합하여 합성 접합부를 준비한다. 어닐은 95°C에서 5분 간 가열한 다음 1°C/min의 속도로 RT로 천천히 냉각한 후, 열 블록 또는 PCR 열자전거러를 사용하여 원하는 냉각 속도를 달성합니다. 10% 트리스-보레이트-EDTA 폴리아크릴아미드 젤의 8cm x 8cm에 혼합물을 적재한다. 100V를 바르고 ~2시간 동안 젤을 실행합니다. 밴드는 눈으로 선명하고 색상은 보라색입니다. 깨끗한 블레이드로 어닐링 된 기판의 밴드를 절제하십시오. 젤 조각을 오토클레이브 된 1.5 mL 튜브로 옮김. 깨끗한 플런저로 튜브 내부의 젤 조각을 분쇄한 다음 TE100 버퍼 100 μL을 추가합니다(표1). HJ를 1,500 rpm에서 20°C에서 1,500 rpm에서 흔들어 서모믹서에서 ~2시간 동안 또는 4°C에서 밤새 배양하여 HJ를 추출한다. 기판(35)을함유하는 용액상에 에탄올 침전을 수행한다. TE100 버퍼의 20 μL에서 기판을 다시 일시 중단한다(표1). 최종 농도는 각 튜브에서 1–3 μM. Aliquot 2 μL이고 -20°C에서 저장한다. 5. GEN1의 단백질 발현 및 정제 엔트리 벡터의 PCR에 의해 C-종점(20)에서 헥사 히티딘 태그와 함께 잘린 인간 GEN1 1,2,3,4,5의 발현을 위한 플라스미드를 구성한다.참고: N-터미널 태그 지정하면 GEN1이 비활성화됩니다. 구조화되지 않은 C-tail은 전체 길이 GEN1의 정제를 훨씬 더 어렵게 합니다. 또한 전체 길이 GEN1은 잘린 버전23보다적은 활성을 나타내는 것으로 보고되었습니다. 발현 벡터를 대장균 BL21-코돈플러스(DE3)-RIPL 스트레인으로 변환합니다. 형질전환된 세포를 각각 37°C에서 루리아 국물 2L를 함유하는 2개의 6L 플라스크로 접종하고, 0.8의 OD600에 도달할 때까지 180 rpm에서 흔들어. 배양을 16°C로 냉각시키고 48시간 동안 0.1 mM 이소프로필-β-β-d-티오갈라코피라노사이드(IPTG)로 GEN1 발현을 유도한다. 원심분리기에서 1000 x g에서 4°C에서 세포를 회전시켜 세포를 수확합니다. 배양의 각 리터는 펠릿의 5–6 g을 산출합니다. 상판을 버리고 세포의 4 mL /g를 사용하여 용해 완충제(표 1)에서펠릿 세포를 다시 일시 중단하십시오. 30 kPsi에서 세포 파괴를 사용하여 세포 용해를 수행한 다음 4 °C에서 1 시간 동안 10,000 x g에서 회전합니다. 상한체를 수집하고 0.45 μm 필터를 사용하여 얼음에 걸으하십시오. 완충액 A(표 1)를 사용하여 2.5 ml/min 유량에서 5 mL Ni-NTA 컬럼을 통해 여과액을 통과시킴으로써 FPLC를 사용하여 단백질정제를수행한다. 15 개의 열 볼륨 (CV)으로 씻으하십시오. 버퍼 A와 500 mM Imidazole의 선형 그라데이션으로 5 mL 분획에서 20 CV 이상을 용해시다. GEN1은 약 100mM 의 이미다졸에서 기둥에서 단송합니다. 수집된 분획으로부터 의 피펫 10 μL aliquots는, 각 aliquot에 2x SDS 로딩 염료의 동일한 부피를 추가한다. 90 °C에서 5분 동안 가열하여 시료를 변성시키고, 냉각시키고, 시료를 스핀다운합니다. 샘플을 10% 비스-트리스 젤에 로드합니다. 쿠마시 브릴리언트 블루를 사용하여 200 V. 얼룩에서 30-45분 동안 젤을 실행한 다음 얼룩을 지입니다. 정제된 GEN1을 포함하는 분수를 수집합니다. 완충제C(표 1)를이용하여 희석하여 결합된 분획의 염 농도를 100 mM으로 감소시다. 완충B(표1)를사용하여 3 mL/min의 유량으로 5 mL 헤파린 컬럼을 통해 저염 단백질을 전달한다. 버퍼 B와 1 M NaCl 20 CV의 그라데이션을 사용하여 10 CV. Elute로 세척합니다. GEN1이 약 360 mM NaCl을 용출하는 5 mL 분획을 수집합니다. 5.8단계에서 설명한 바와 같이 용출된 분획물정제 GEN1 분획을 확인한다. 그 분획을 결합하고 버퍼 C를 사용하여 100mM NaCl에 희석. 버퍼 B를 사용하여 1 mL /min 유량으로 양이온 교환 컬럼에 낮은 소금 단백질을 로드하십시오. 버퍼 B 및 1 M NaCl을 사용하여 40 CV의 그라데이션으로 용해. GEN1이 약 300 mM NaCl을 용출하는 1.7 mL 분획을 수집합니다. 5.8단계에서 설명한 바와 같이 용출 분획에서 GEN1의 순도를 확인한다. 가장 순수한 분획을 결합하고 4°C에서 투석을 저장 완충제에 대고있다(표 1). 투석 중에 버퍼를 하나 이상 교환합니다. 단백질 농도를 측정 ~0.5–1 mg/mL. 투석 단백질을 10-15 μL의 작은 튜브에 담고 액체 질소에서 플래시 동결하고 -80 °C에서 보관하십시오. 6. 단 분자 FRET 실험 참고: smFRET 실험은 앞서31에설명된 맞춤형 목표 기반 TIRF설정(그림 1C)에서수행됩니다. 단색 FRET 실험 100x TIRF 목표에 한 방울의 침지 오일을 적용합니다. EMCCD를 적절한 게인으로 설정하여 신호가 배경에 최적화되고 채도를 방지합니다.참고: 레이저 빔을 직접 들여다보지 말고 레이저를 정렬할 때 보호 고글을 착용하십시오. 샘플 홀더에 유량 셀을 조심스럽게 놓습니다. 오일이 커버 슬립에 닿을 때까지 거친 조정을 사용하여 점차적으로 목표를 올립니다. 녹색 레이저(532nm)를 켭니다. 목표의 미세 조정 모드로 전환합니다. 카메라 포트에 방출을 지시하여 모니터의 이미지를 관찰합니다. 커버슬립의 기능화된 표면이 초점이 맞춰질 때까지 목표의 높이를 조정하고 모니터에서 관찰할 수 있습니다.참고: EMCCD의 이미지 수집은 acousto optic 튜닝 필터(AOTF)를 통해 레이저 흥분을 유발하여 이미지가 획득되지 않을 때 샘플 광표백을 방지합니다. 커버의 기능화 된 표면의 배경이 형광으로 표시된 HJ로 흐르기 전에 몇 가지 지점을 초과하지 않는지 확인하십시오. TE100 완충액(표1)에서스톡 기판을 1-5 nM의 최종 농도로 약 1000회 희석한다. 희석된 기판의 피펫 0.2-0.5 μL을 0.5 mL 튜브내로 OSS를 가진 이미징 버퍼의 120 μL로 한다. 유량 셀의 출구를 주사기 펌프에 연결합니다. 유량 전지의 입구 튜브를 1.5 mL 튜브에 삽입하고 30-50 μL/min의 유량으로 주사기 펌프를 작동하여 튜브에서 용액을 인출합니다. 녹색 레이저로 간략하게 이미징하여 표면의 커버리지(균일하게 분산된 잘 간격이 있는 기판 100-300)를 자주 확인합니다. 표면 커버리지가 여전히 충분하지 않은 경우 형광으로 표지된 HJ가 용액으로부터 몇 분 동안 기다려 표면에 정착하거나 흐르는 단계를 반복한다. 또 다른 120 μL의 이미징버퍼(표 1)를30-50 μL/min에서 흐르고, HJ라고 표기된 언바운드 형광으로 세척한다. 그런 다음 유동 세포가 5 분 동안 앉아서 OSS가 용존 산소를 고갈 할 수 있도록하십시오. 형광단의 광표백은 이미징 시작 시 최소화되어야 합니다. 노출 시간(~60ms)을 설정하면, 사이클 시간은 데이터 전송 속도(~104ms)에 따라 소프트웨어에 의해 자동으로 설정되고, 원하는 사이클 또는 프레임 수(~400)를 지정한다. 기증자(Cy3) 및 수락자(Alexa Fluor 647)로부터의 방출은 이미지 스플리터 장치에 의해 2개의 컬러 채널로 분할된다. 표면에 적합한 영역을 찾아 목표의 높이를 조정하여 이미지에 초점을 맞추고 기록하고 16 비트 TIFF 형식으로 영화를 저장합니다. 새 영역으로 이동합니다.참고: 동일한 영역을 두 번 이미징하지 않으려면 항상 한 방향으로만 이동하십시오(즉, 콘센트에서 입구까지). 이미징 버퍼의 120 μL에서 1, 2, 5, 10, 25, 50, 75 및 100 nM GEN1을 한 번에 하나씩 준비합니다. 용액을 30-50 μL/min의 유량으로 유량합니다.참고: GEN1에 의한 HJ 바인딩 또는 자유 HJ의 이성화와 같이 필요한 측정이 정상 상태에서 수행되는 경우, 흐름이 중지된 후 3-5분 정도 기다려 영화를 녹화합니다. 각 GEN1 농도에 대해 새로운 영역에서 3~4개의 영화를 수집합니다. GEN1에 의한 HJ의 분열에서와 같이 연속적인 흐름 하에서 측정이 수행되는 경우, GEN1이 유동 셀로 들어가기 전에 5-10초의 기록을 시작합니다. 6채널 유량 셀의 새 채널로 이동하여 측정을 반복합니다. 끝에서, 고정 형광 비드 슬라이드를 사용하여 이미지 분할 장치에서 공여자 및 수용자 입자를 서로 매핑합니다. 0.2 μL의 1 μm 직경형 형광 비드를 500 μL의 1 M Tris (pH = 8.0)에 추가하여 비드가 표면에 달라붙도록 합니다. 양면 접착 씰의 22mm x 22mm 조각 내부에 사각형(18mm x 18mm)을 자른다. 껍질을 벗기고 76mm x 25mm 쿼츠 슬라이드의 중간에 붙입니다. 희석된 구슬 용액 50 μL을 놓고 5-10분 동안 그대로 둡니다. 정사각형 조각 위에 22mm x 22mm 커버슬립을 부착합니다. 티슈로 마른 과잉 비드 용액을 마른 다음 에폭시 접착제로 챔버를 밀봉하십시오. 60ms 노출 시간에 구슬 슬라이드의 100 프레임을 획득합니다.주의: 검출기의 포화를 피하기 위해 레이저 전력과 EMCCD 게인을 최소한으로 낮추세요. 소프트웨어 패키지(예를 들어, TwoTones)를 설치하고 사용자매뉴얼(36)에표시된 대로 그 안에 있는 영화를 엽니다. 기증자 및 수락자 채널에서 개별 비드의 위치를 선택합니다. 설명서에 설명된 대로 변환 행렬을 생성합니다.참고 :이 소프트웨어는 기증자 및 수락자 채널의 입자의 위치를 일치시키고 이미지 분할 장치의 약간의 정렬 불량에 대한 수정 변환 매트릭스를 사용합니다. 파일로이동하여 동영상 로드를 누릅니다. 파일 메뉴에서 TFORM 로드를 누르고 비드 슬라이드에서 생성된 변환 행렬을 선택합니다. 거짓 긍정이 포함되지 않을 때까지 기증자 및 수락자 채널의 임계값을 조정합니다. 채널 필터 메뉴에서 D&A 옵션을 선택하여 기증자와 수락자 로 레이블이 지정된 파티클을 선택합니다. 가장 가까운 이웃 한계 필드를 확인하여 서로 매우 가까운 분자를 제외합니다. 최대 타원성을 확인하여 매우 편심 분자를 배제하고 너비 제한을 확인하여 매우 광범위하거나 매우 좁은 분자를 제외합니다. 히스토그램을 구성하기 위해 투톤 매뉴얼에서 지시한 대로 plotHistCW를 입력합니다.참고: “명백한” FRET 효율은 수용자의 배출량을 기증자와 수락자로부터의 총 배출량으로 나누어 프로그램에 의해 계산됩니다. 투톤은 100 간격을 사용하여 FRET 효율에 대한 분자 상태의 분포를 bin합니다. 각 분자에 대한 시간 추적을 생성하기 위해 투톤 매뉴얼에서 지시한 대로 plotTimetraceCW를 입력합니다.참고: 시간 추적은 vbFRET37에 의해 추가로 분석되어 서로 다른 FRET 상태, 각 거주 시간 및 서로 다른 상태 간의 전환 속도를 식별할 수 있습니다. 2색 교대로 여기 FRET (ALEX) 실험 녹색 및 적색 레이저와 직접 여기하여 기증자 및 수락자 방출의 연속 프레임으로 구성된 영화를 각각 ~ 80 ms 의 지속 시간으로 기록합니다. 투톤에서 인수 된 ALEX 영화를 엽니 다. 3개의 채널에 대해 ~300으로 적합한 검출 임계값을 설정: 기증자 여기로 인한 공여자 방출(DexDem); 기증자 여기로 인한 수용자 방출 (DexAem); 직접적인 여기 (AexAem)로 인한 수락자 방출. 채널 필터 덱스뎀 & 덱스엠 & AexAem을 적용하여 기증자와 수락자가 모두 있는 파티클을 선택합니다. 입자를 3개의 채널에서 ~200-300으로 연결합니다. 플롯HistALEX MATLAB 코드를 사용하여 ALEX 히스토그램을 생성합니다. 히스토그램의 다른 피크를 가우시안 함수에 맞추고 Origin 소프트웨어38을사용하여 곡선 아래의 영역을 각 모집단의 백분율을 결정합니다.참고: 결합 분석의 피크는 결합된 GEN1-HJ 복합체에 해당하며, 자유 HJ에서는 피크가 교환이성 이소메를 나타냅니다. plotTimetraceALEX MATLAB 코드를 사용하여 직접 여기및 FRET 및 직접 여기로 인한 공여체 방출을 나타내는 각 분자에 대한 시간 추적을 생성합니다.참고: ALEX 시간 추적은 독립적으로 기증자와 수락자 모두의 방출을 보여주지만 단색 FRET보다 낮은 시간 해상도로 표시됩니다. 단일 색상 FRET와 마찬가지로 ALEX 시간 추적은 vbFRET에 의해 추가로 분석되어 다른 FRET 상태와 해당 거주 시간을 식별할 수 있습니다. 쌍곡선 함수에 GEN1 농도 대 바운드 모집단의 백분율을 피팅하여 해리 상수를 결정합니다. 타임랩스 단색 FRET 관찰된 역학의 속도에 따라 녹색 레이저의 노출 시간을 60ms로 설정하고 사이클 시간을 624ms 이하로 설정합니다. 6채널 유량 셀의 한 채널에서 유량을 110μL/min으로 설정합니다. 흐름 셀 내부의 GEN1 입구 전에 잠시 레코딩을 시작합니다.참고: 연속적인 흐름은 형광단의 빠른 광표백으로 이어지므로 이미징 및 단백질 입력의 시작을 동기화하여 캡처된 이벤트의 수를 최대화합니다. 최적의 주사기 펌프 판독은 죽은 볼륨과 유량 셀을 조립하는 데 사용되는 정확한 튜브에 따라 달라집니다. 우리의 경우 ~ 25 μL입니다. 총 78s의 촬영 시간 동안 ~ 125 프레임의 영화를 획득합니다. 기록의 끝에서, 수용기를 조사하기 위해 각각 25 ms 노출 시간으로 50 프레임 동안 적색 레이저에 샘플을 노출시다.참고: 이 방법은 여기 주기 수를 줄임으로써 분열 실험에서 관찰 창을 연장합니다. 이량화의 k및 k오프와 같은 운동 파라미터는 분포를 이중 지수모델(30,38)에피팅하여 유도된다. 7. 전기 적 이동성 변화 분석 (EMSA) 50 μL 총 부피에서, EMSA 결합 완충액에서 30분 동안 RT에서 50 pM Cy5 표지된 HJ로 GEN1의 원하는 농도를 배양한다(표1). 샘플을 트리스-붕산도-EDTA 젤의 8cm x 8cm에 적재합니다. RT에서 1x TBE 버퍼에서 100V를 1시간 동안 + 20분 동안 사용하여 젤을 실행합니다. 각 레인의 총 형광 강도에 대한 상대적 기여도에서 GEN1 농도에서 바운드 기판의 백분율을 결정합니다.참고 : GEN1 단량체 -HJ (밴드 I)는 닉 HJ21,30에GEN1 단량체의 피코몰러 바인딩과 크기의 계약에 의해 확인된다. GEN1-디머-HJ는 HJ21,23에GEN1 단량체의 단계적 결합 때문에 밴드 II에 할당된다. 방정식을 사용하여 명백한 바인딩 상수 Kd-단량체 앱-EMSA 및 Kd-dimer-app-EMSA를 계산합니다.어디에: 최대는 각 종의 최대 결합 (단량체 또는 이량체)에 도달한 농도입니다. n은 언덕 계수입니다. K (주) d-app-EMSA는 각 종의 명백한 결합 상수이며, 단량체 또는 이량체의 절반 최대가 존재하는 GEN1의 농도를 나타냅습니다.