Presentato qui è un protocollo per l’esecuzione di trasferimento di energia di risonanza monomolecola di Fàrster per studiare la risoluzione HJ. L’eccitazione alternata a due colori viene utilizzata per determinare le costanti di dissociazione. Il time lapse a colori singolo smFRET viene quindi applicato nei saggi di scissione in tempo reale per ottenere la distribuzione del tempo di dimora prima della risoluzione HJ.
I metodi sfusi misurano il comportamento di insieme delle molecole, in cui i tassi di reazione individuali dei passi sottostanti sono mediati in tutta la popolazione. Il trasferimento di energia di risonanza a singola molecola (smFRET) fornisce una registrazione dei cambiamenti conformazionali che avvengono da singole molecole in tempo reale. Pertanto, smFRET è potente nel misurare i cambiamenti strutturali nell’enzima o nel substrato durante il legame e la catalisi. Questo lavoro presenta un protocollo per l’imaging a singola molecola dell’interazione di una giunzione ostilia a quattro vie (HJ) e di endonuclease I (GEN1), un enzima citosolico omologa di ricombinazione. Sono stati presentati anche protocolli sperimentali smFRET a colori e a due colori per seguire la risoluzione dell’HJ di GEN1 in tempo reale. La cinetica della dimerizzazione GEN1 è determinata presso l’HJ, che è stato suggerito per svolgere un ruolo chiave nella risoluzione dell’HJ ed è rimasto sfuggente fino ad ora. Le tecniche qui descritte possono essere ampiamente applicate per ottenere preziose intuizioni meccanicistiche di molti sistemi enzimatico-DNA.
I metodi a singola molecola basati sul rilevamento della fluorescenza forniscono elevati rapporti segnale-rumore1. FRET è una tecnica spettroscopica in grado di misurare le distanze nell’intervallo di 1-10 nm, rendendo questa tecnica come righello molecolare per misurare le distanze nell’intervallo nanometrico2,3. Lo spettro di assorbimento dell’accettatore presenta una sovrapposizione spettrale parziale con lo spettro di emissione del donatore all’estremità della lunghezza d’onda più corta. FRET è mediato dal trasferimento di energia senza radiazioni tra una coppia di donatori e accettanti, mentre l’efficienza del trasferimento di energia dipende dalla distanza e dall’orientamento dell’accettatore4 .
Sono stati implementati diversi approcci per ridurre al minimo lo sfondo e migliorare l’efficienza di rilevamento del segnale di fluorescenza5,6. Un approccio è la microscopia confocale, in cui un foro stenopeico limita il punto di eccitazione a una dimensione inferiore al limite di diffrazione7. Un altro approccio è la fluorescenza totale di riflessione interna (TIRF), che è una tecnica di illuminazione a campo largo in cui la luce è diretta fuori asse sopra un angolo critico8. La luce viene quindi totalmente riflessa internamente all’interfaccia tra il vetro e la soluzione acquosa, generando un’onda evanescente che illumina solo i fluorofori attaccati alla superficie del vetro e impedisce lo sfondo dai fluorofori nel resto la soluzione.
Nella microscopia confocale, le molecole possono essere liberamente diffuso o immobilizzate superficiali. La risoluzione temporale raggiunta può essere entro microsecondi a diversi millisecondi9. Il rilevamento confocale per una singola molecola viene eseguito mediante diodo da valanga a singolo fotone (SPAD) e la scansione punto per punto della regione di interesse10. In TIRF, una serie temporale di poche centinaia di molecole immobilizzate sulla superficie è registrata da un rilevatore bidimensionale a carica bidimensionale (CCD) sensibile alla posizione. Il CCD amplifica il segnale di fluorescenza mediante schermo di fosforo intensificato e piastra a microcanale o moltiplicazione su chip di fotoelettroni (EMCCD). La risoluzione temporale dipende dalla velocità di lettura e dall’efficienza quantistica del CCD e di solito dall’ordine di poche decine di millisecondi6.
HJ è un intermedio centrale nella riparazione e ricombinazione del DNA11,12,13,14. HJ ha due fili continui e due di incrocio che si collegano tra i fili continui senza intersecarsi l’uno con l’altro. HJ esiste in soluzione come conformatori X-stacked, che subiscono la continua isomerizzazione da parte dei fili continui che diventano incrociando e i fili di attraversamento diventando continuo nell’altro conformer15. Isomer preferenza del HJ dipende dalla sequenza di base e ambiente ionico ed è stato ampiamente studiato da FRET16,17,18,19.
GEN120 è una proteina monomerica nella soluzione21 e richiede la dimerizzazione per fendere l’HJ, consentendo così una corretta separazione dei fili ricombinati22,23. La preferenza di accatastamento conformer dell’HJ influenza l’esito della ricombinazione genetica impostando l’orientamento della risoluzione da parte dei risolvi HJ24. Capire come GEN1 lega l’HJ, coordina le due incisioni e assicura che la sua risoluzione completa sia stata tutte oggetto di studio intensivo21,22,23,25,26 ,27,28,29,30.
In questo studio, viene utilizzato un allestimento TIRF basato su obiettivo come descritto in precedenza31. L’eccitazione alternata a due colori (ALEX) viene applicata per determinare i cambiamenti conformazionali al momento dell’interazione di GEN1 con fluoroforo etichettato HJ. ALEX produce istogrammi 2D basati su due parametri ratiometrici di efficienza FRET E, che è donatore-accettatore a seconda della distanza, e il parametro stoichiometria S, che misura la stoichiometria donatore-acceleratore32. ALEX consente lo smistamento di specie fluorescenti in base alle stoichiometrie dei fluorofori, tra cui sola donazione, solo accetto e sottopopolazioni miste. ALEX può estendere l’uso di FRET all’intera gamma e può rilevare le differenze nella luminosità e nell’oligomerizzazione del fluoroforo, nonché monitorare le interazioni macromolecola-ligando33.
Si è scoperto che GEN1 riesce costantemente a risolvere l’HJ entro la durata del complesso GEN1-HJ. I cambiamenti conformazionali dipendenti dal tempo derivano dalle tracce temporali delle singole molecole, mentre gli istogrammi rappresentano la distribuzione delle popolazioni sottostanti. Utilizzando FRET monocolore time-lapse, sono dimostrati rapidi on-rate e tempi di off-rate lenti per il dimero GEN1, che aumentano l’affinità del dimero GEN1 assemblato al primo prodotto di incisione.
In questo studio sono state implementate diverse tecniche smFRET per determinare la cinetica della risoluzione HJ da GEN130. Approcci smFRET simili sono stati utilizzati per seguire il fabbisogno conformealmente del DNA a doppio lembo e la scissione mediante la replicazione del DNA e la riparazione del lembo endonuclease 142,43,44. In questo caso vengono illustrati i passaggi critici di questo protocollo. La reazione di insilanizzazione dovrebbe essere libera da qualsiasi traccia di umidità. La soluzione di pegilazione deve essere applicata rapidamente al vetro silanizzato una volta che il PEG viene sciolto per evitare l’idrolisi. Nella cella di flusso multicanale, qualsiasi aria intrappolata nel foglio adesivo deve essere rimossa per evitare perdite tra i canali vicini. La soluzione PCA deve essere appena preparata in quanto si ossida nel tempo. L’aggiunta di 10 N NaOH dovrebbe essere dropwise, con vortice in mezzo. Lo sfondo a fluorescenza nel coperchio deve essere minimo prima di fluorescenza etichettato HJ. L’imaging nella cella di flusso deve essere eseguito in una direzione per evitare l’imaging di aree sbiancate. Negli esperimenti ALEX, la potenza del laser rosso dovrebbe essere ridotta per evitare uno sbiancamento rapido dell’accettatore. Negli esperimenti time-lapse, il tempo di ciclo deve essere più breve dell’evento più veloce.
smFRET è una tecnica sensibile che può fornire preziose intuizioni in tempo reale nelle reazioni biomolecolari. Tuttavia, questo metodo ha diverse sfide tecniche, tra le quali sta ottenendo un cambiamento misurabile in FRET durante la reazione biochimica. Ciò è necessario per ottenere caratteristiche ben separate negli istogrammi e negli stati distinguibili nelle tracce temporali. In molti casi, smFRET richiede un’attenta progettazione dei substrati, selezione delle coppie di fluorofori e delle loro posizioni, e amplificazione dei cambiamenti FRET nel substrato di DNA a causa dei piccoli cambiamenti strutturali nel substrato45. Un altro approccio per l’esecuzione di FRET è quello di utilizzare proteine etichettate46. La finestra di osservazione in FRET è limitata dalla stabilità dell’accettatore come Cy5 o Alexa Fluor 647 che tende a sbiancarsi più rapidamente del donatore (Cy3 in questo caso). Pertanto, FRET richiede una continua ricerca di fluorofori stabili per estendere la durata dell’esperimento e gli sforzi per sviluppare sistemi di scavenging di ossigeno per prolungare il segnale di fluorescenza e massimizzare il rapporto segnale-rumore47,48 .
Tra i suggerimenti per la risoluzione dei problemi in smFRET c’è il bilanciamento dei diversi parametri coinvolti nell’imaging come la potenza laser, il tempo di esposizione, il tempo di ciclo e il numero di cicli per massimizzare l’emissione di fluorescenza, prolungare la durata dell’esperimento e raggiungere adeguati intervalli di campionamento per la dinamica enzimatica. Tempi di osservazione più lunghi e effetti minimi derivanti dal fotosbiancamento sono essenziali per ottenere distribuzioni di tempo di perazione ad alta fedeltà che rappresentano la dinamica degli enzimi. ALEX genera istogrammi migliori poiché questo metodo è sottoposto a minori contributi da particelle fotosbiancate rispetto al FRET monocolore. Tuttavia, la risoluzione temporale in ALEX è inferiore a quella in FRET monocolore.
Infine, l’enfasi di smFRET sulla rilevazione di cambiamenti conformi/strutturali nelle singole molecole in tempo reale colma il divario tra le tecniche strutturali ad alta risoluzione (cioè la cristallografia a raggi X, la risonanza magnetica nucleare, la microscopia elettronica), che fornisce dettagli strutturali a risoluzione atomica in condizioni statiche e metodi di massa che producono la media dell’insieme di una proprietà misurabile. In molti aspetti, smFRET si è dimostrata una potente tecnica per studiare i sistemi biologici in tempo reale.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto da King Abdullah University of Science and Technology attraverso il finanziamento di base e il Premio di ricerca competitiva (CRG3) a S. M. H.
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) | Sigma-Aldrich | 238813 | |
0.1 M sodium bicarbonate buffer | Fisher | 144-55-8 | |
10 % Novex Tris-Borate-EDTA gel | Thermo Fisher Scientific | EC6275BOX | |
100 X TIRF objective | Olympus | NAPO 1.49 | |
3,4-dihroxybenzoic acid (PCA) | Sigma-Aldrich | P5630 | |
3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | 741442 | |
6% Novex Tris-Borate-EDTA gel | Thermo Fisher Scientific | EC6265BOX | |
Adhesive sheet | Grace bio-labs | SA-S-1L | |
Benchtop refrigerated centrifuge | Eppendorf | Z605212 | |
Biotin-PEG | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA 5000 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | New England Biolabs | B9001S | |
Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | 31307 | |
cation exchange column | GE healthcare | MonoS (4.6/100) | |
Cell distruptor | Constant Cell Disruption System | TS5/40/CE/GA | |
Coomassie Brilliant Blue | MP Biomedicals | 808274 | |
Cy3 emission filter | Chroma | HQ600/40M-25 | |
Cy5/Alexa Fluor 647 emission filter | Chroma | HQ700/40M-25 | |
Dichroic for DV2 filter cube | Photometrics | 630dcxr-18×26 | |
Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | R0861 | |
Drill | Dremel | 200-1/21 | |
Electronic cutter | Copam | CP-2500 | |
EMCCD camera | Hamamatsu | C9100-13 | |
Epoxy glue | Devcon | 14250 | |
FPLC Aktapurifier UPC 10 | GE Healthcare | 28406268 | |
GelQuant.NET software | biochemlabsolutions.com | Version 1.8.2 | |
GEN1 entry vector | Harvard plasmid repository | HSCD00399935 | |
Glycerol | Sigma Life Science | G5516 | |
green laser (emission 532 nm) | Coherent | Compass 315M-100 | |
Heparin column | GE healthcare | HiTrap Heparin column | |
HEPES | BDH | BDH4162 | |
Image splitter | Photometrics | Dualview (DV2) | |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
Inverted microscope | Olympus | IX81 | |
Isopropyl-ß-D-thiogalactoside (IPTG) | Goldbio. | 12481C100 | |
Laser scanner | GE healthcare | Typhoon Trio | |
LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
Long pass 532nm filter | Semrock | LPD02-532RU-25 | |
Magnesium Chloride | Sigma Life Science | M8266 | |
mPEG | Laysan Bio | mPEG-SVA 5000 | |
Neutravidin | Pierce | 31000 | |
Ni-NTA column | GE healthcare | HisTrap FF | |
NuPAGE 10% Bis-Tris gels | Novex Life technologies | NP0301BOX | |
NuPAGE 10% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NP0302PK2 | |
Origin software | OriginLab Corporation | Version 8.5 | |
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Alexis Biochemicals | 270-184-G025 | |
Phosphate-buffered saline | GIBCO | 14190 | |
Polyethylene Tubing (I.D. 0.76 mm O.D. 1.22mm) | Fisher (Becton Dickinson) | 427416 | |
Protocatechuate 3,4-dioxygenase (3,4-PCD) | Sigma-Aldrich | P8279-25UN | |
Quad-band dichroic | Chroma Inc | Z405/488/532/640rpc | |
red laser (emission 640 nm) | Coherent | Cube 640 100C | |
Sodium Chloride | Fisher Chemical | S271 | |
Sorvall RC-6 plus centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46910 | |
Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000 | |
Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3007 | |
Teflon tweezers | Rubis | K35A | |
Tris Base | Promega | H5135 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-90K | |
Ultrafiltration membrane | Millipore | UFC90300 |