يعرض هنا بروتوكول لتنفيذ جزيء واحد Förster نقل الطاقة الرنين لدراسة قرار HJ. يتم استخدام الإثارة بالتناوب بلونين لتحديد ثوابت التفكك. ثم يتم تطبيق smFRET الفاصل الزمني لون واحد في الاختبارات الانقسام في الوقت الحقيقي للحصول على توزيع الوقت يسكن قبل قرار HJ.
تقيس الطرق السائبة سلوك المجموعة من الجزيئات، حيث يتم متوسط معدلات التفاعل الفردية للخطوات الأساسية في جميع أنحاء السكان. يوفر نقل الطاقة بالرنين (smFRET) أحادي الجزيء تسجيلًا للتغيرات المطابقة التي تحدثها الجزيئات الفردية في الوقت الحقيقي. ولذلك، smFRET قوية في قياس التغيرات الهيكلية في الإنزيم أو الركيزة أثناء الربط والحفز. يقدم هذا العمل بروتوكولًا لتصوير جزيء واحد للتفاعل بين تقاطع هوليداي رباعي الاتجاه (HJ) وفجوة إندونوكليس الأول (GEN1)، وهو إنزيم إعادة تركيب متجانس دوري. كما تقدم هي لون واحد واثنين من لون بالتناوب الإثارة (أليكس) smFRET البروتوكولات التجريبية لمتابعة قرار HJ من قبل GEN1 في الوقت الحقيقي. يتم تحديد حركية التمهّل GEN1 في HJ، الذي اقترح أن يلعب دوراً رئيسياً في حل HJ وظلت بعيدة المنال حتى الآن. التقنيات الموصوفة هنا يمكن تطبيقها على نطاق واسع للحصول على رؤى ميكانيكية قيمة للعديد من أنظمة الحمض النووي الإنزيم.
توفر أساليب جزيء واحد على أساس الكشف عن الفلورة نسب إشارة إلى ضوضاء عالية1. FRET هو تقنية مطيافية يمكن قياس المسافات في نطاق 1-10 نانومتر، مما يجعل هذه التقنية كمسطرة جزيئية لقياس المسافات في نطاق نانومتر2،3. وطيف امتصاص المقبل له تداخل طيفي جزئي مع طيف انبعاثات المانح في نهاية الطول الموجي أقصر. يتم التوسط في فريت من خلال نقل الطاقة أقل من الإشعاع بين المانح وزوج مقبول، في حين أن كفاءة نقل الطاقة تعتمد على المسافة والتوجه من مقبول4.
وقد تم تنفيذ العديد من النهج لتقليل الخلفية وتحسين كفاءة الكشف عن إشارة الفلورة5و6. نهج واحد هو الفحص المجهري البؤري، حيث ثقب يقيد بقعة الإثارة إلى حجم أقل من الحد الانعراج7. وثمة نهج آخر هو الفلورة التأمل الداخلي الكلي (TIRF)، وهو تقنية إضاءة واسعة المجال حيث يتم توجيه الضوء خارج المحور فوق زاوية حرجة8. ثم ينعكس الضوء داخليا تماما في واجهة بين الزجاج والحل المائي، وتوليد موجة المبشرة التي تضيء فقط الفلوروفورتعلق على سطح الزجاج ويمنع الخلفية من الفلوروفور في بقية الحل.
في الفحص المجهري البؤري، يمكن أن تكون الجزيئات إما نشر بحرية أو تعطيل السطح. يمكن أن يكون القرار الزمني الذي تم تحقيقه ضمن ميكروثانية إلى عدة مللي ثانية9. يتم إجراء الكشف البؤري لجزيء واحد بواسطة صمام ثنائي الانهيارات الثلجية أحادي الفوتون (SPAD) والمسح الضوئي نقطة بنقطة من المنطقة ذات الاهتمام10. في TIRF، يتم تسجيل سلسلة زمنية من بضع مئات من الجزيئات المعطلة على السطح بواسطة جهاز كشف ثنائي الأبعاد حساس للموقف مقترن بـ (CCD). وتزيد اتفاقية مكافحة التصحر من إشارة الفلورة إما عن طريق تكثيف شاشة الفوسفور ولوحة القناة الدقيقة أو عن طريق الضرب على رقاقة الإلكترونات الضوئية (EMCCD). القرار الزمني يعتمد على سرعة القراءة وكفاءة الكم من اتفاقية مكافحة التصحر وعادة على ترتيب بضع عشرات من مللي ثانية6.
HJ هو وسيط مركزي في إصلاح الحمض النووي وإعادة تركيب11،12،13،14. HJ اثنين من خيوط عبور مستمرة واثنين من التي تربط بين خيوط مستمرة دون تقاطع بعضها البعض. HJ موجود في الحل كما X-مكدسة المعاقات، والتي تخضع للايزومرات المستمر من قبل خيوط مستمرة تصبح عبور وخيوط عبور تصبح مستمرة في15conformer أخرى. تفضيل أيزومر من HJ يعتمد على التسلسل الأساسي والبيئة الأيونية وقد درست على نطاق واسع من قبل اريت16،17،18،19.
GEN120 هو بروتين أحادي في الحل21 ويتطلب التميّز لشق HJ، مما يسمح بالفصل السليم للخيوط المعاد دمجها22،23. تفضيل التجصيّق للـ HJ يؤثر على نتيجة إعادة التركيب الوراثي من خلال تحديد اتجاه القرار من قبل HJ resolveases24. فهم كيفية ربط GEN1 HJ، وتنسيق الشقين، ويضمن حلها الكامل كانت جميعها تحت دراسة مكثفة21،22،23،25،26 ،27،28،29،30.
في هذه الدراسة، يتم استخدام إنشاء TIRF على أساس موضوعي كما هو موضح سابقا31. يتم تطبيق الإثارة بالتناوب بلونين (ALEX) لتحديد التغيرات المطابقة عند تفاعل GEN1 مع الفلوروفور المسمى HJ. ALEX تنتج 2D الرسوم البيانية على أساس اثنين من المعلمات قياس النسب ة كفاءة E، وهو المانح ة يقبل تعتمد على بعد، والمعلمة stoichiometry S، الذي يقيس stoichiometry المانحة والمقبولة32. اليكس تمكن من فرز الأنواع الفلورية على أساس stoichiometries من الفلوروفورس بما في ذلك المانحين فقط، ومقبول فقط، ومجموعة فرعية مختلطة. ALEX يمكن توسيع نطاق استخدام FRET إلى مجموعة كاملة ويمكن الكشف عن الاختلافات في سطوع الفلوروفور وoligomerization وكذلك رصد التفاعلات جزيء ligand33.
وقد وجد أن GEN1 ينجح باستمرار في حل HJ خلال عمر مجمع GEN1-HJ. وتستمد التغيرات المطابقة المعتمدة على الوقت من آثار الزمن للجزيئات الفردية، في حين أن الرسوم البيانية تمثل توزيع السكان الأساسيين. باستخدام الفاصل الزمني لون واحد FRET، يتم عرض سريع على معدلات وبطء معدلات قبالة لDIMER GEN1، مما يزيد من تقارب ديمر GEN1 تجميعها في المنتج شق الأول.
في هذه الدراسة، تم تنفيذ تقنيات smFRET مختلفة لتحديد حركية قرار HJ من قبل GEN130. وقد استخدمت نهج smFRET مماثلة لمتابعة متطلبات مطابقة الحمض النووي رفرف مزدوج والانقسام من قبل النسخ المتماثل الحمض النووي وإصلاح رفرف endonuclease 142،43،44. هنا، تتم مناقشة الخطوات الهامة في هذا البروتوكول. يجب أن يكون رد فعل السيلان خالية من أي أثر للرطوبة. يجب تطبيق حل البيغيليشن بسرعة على الزجاج السيلاني بمجرد حل PEG لتجنب التحلل المائي. في خلية التدفق متعددة القنوات، يجب إزالة أي هواء محاصر في ورقة لاصقة لتجنب التسرب بين القنوات المجاورة. وينبغي أن يكون الحل PCA أعدت حديثا لأنه يتأكسد مع مرور الوقت. إضافة 10 N NaOH ينبغي أن يكون قطرة، مع دوامة في ما بين. يجب أن تكون خلفية الفلورة في غطاء الحد الأدنى قبل أن تتدفق HJ المسمى الفلورسنت. يجب إجراء التصوير في خلية التدفق في اتجاه واحد لتجنب تصوير المناطق المبيضة. في تجارب ALEX، يجب تقليل قوة الليزر الأحمر لتجنب التبييض السريع للمقبول. في تجارب الفاصل الزمني، يجب أن يكون وقت الدورة أقصر من أسرع حدث.
smFRET هو تقنية حساسة التي يمكن أن توفر رؤى قيمة في الوقت الحقيقي في التفاعلات الجزيئية الحيوية. ومع ذلك، فإن هذه الطريقة لديها العديد من التحديات التقنية، من بينها تحقيق تغيير قابل للقياس في فريت أثناء التفاعل البيوكيميائي. هذا ضروري للحصول على ميزات منفصلة بشكل جيد في الرسوم البيانية والدول المميزة في آثار الزمن. في كثير من الحالات، يتطلب smFRET تصميم دقيق للركائز، واختيار أزواج الفلوروفور ومواقفهم، وتضخيم التغييرات في حالة نقص في الحمض النووي في الركيزة بسبب التغييرات الهيكلية قليلا في الركيزة45. نهج آخر لأداء FRET هو استخدام البروتينات المسماة46. ويقتصر نافذة المراقبة في فريت من قبل استقرار مقبول مثل Cy5 أو اليكسا فلور 647 الذي يميل إلى التبييض بسرعة أكبر من المانح (Cy3 في هذه الحالة). لذلك، يتطلب الاتحاد البحث المستمر عن الفلوروفوريس مستقرة لتمديد مدة التجربة والجهود المبذولة لتطوير أنظمة مسح الأكسجين لإطالة إشارة الفلورة وتعظيم نسبة الإشارة إلى الضوضاء47،48 .
من بين النصائح لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها في smFRET هو موازنة العديد من المعلمات المشاركة في التصوير مثل قوة الليزر، ووقت التعرض، ووقت الدورة، وعدد من الدورات لتحقيق أقصى قدر من الانبعاثات الفلورية، وإطالة مدة التجربة، وتحقيق الفواصل الزمنية المناسبة لأخذ العينات لديناميات الإنزيم. تعد أوقات المراقبة والآثار الأدنى من تبييض الصور ضرورية للحصول على توزيعات وقت الجلوس عالية الدقة التي تمثل ديناميات الإنزيم. ALEX يولد أفضل الرسوم البيانية منذ هذا الأسلوب يخضع لمساهمات أقل من الجسيمات الضوئية بالمقارنة مع FRET لون واحد. ومع ذلك، الدقة الزمنية في ALEX أقل من ذلك في FRET لون واحد.
وأخيراً، فإن تركيز smFRET على الكشف عن التغيرات المطابقة/الهيكلية في الجزيئات الفردية في الجسور في الوقت الحقيقي الفجوة بين التقنيات الهيكلية عالية الدقة (أي التصوير البلوري بالأشعة السينية، والرنين المغناطيسي النووي، والمجهر الإلكتروني)، الذي يوفر التفاصيل الهيكلية الدقة الذرية في ظل ظروف ثابتة والأساليب السائبة التي تسفر عن متوسط الفرقة من خاصية قابلة للقياس. في العديد من الجوانب، وقد ثبت smFRET أن تكون تقنية قوية لدراسة النظم البيولوجية في الوقت الحقيقي.
The authors have nothing to disclose.
وقد تم دعم هذا العمل من قبل جامعة الملك عبد الله للعلوم والتكنولوجيا من خلال التمويل الأساسي وجائزة البحوث التنافسية (CRG3) إلى S.M. H.
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) | Sigma-Aldrich | 238813 | |
0.1 M sodium bicarbonate buffer | Fisher | 144-55-8 | |
10 % Novex Tris-Borate-EDTA gel | Thermo Fisher Scientific | EC6275BOX | |
100 X TIRF objective | Olympus | NAPO 1.49 | |
3,4-dihroxybenzoic acid (PCA) | Sigma-Aldrich | P5630 | |
3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | 741442 | |
6% Novex Tris-Borate-EDTA gel | Thermo Fisher Scientific | EC6265BOX | |
Adhesive sheet | Grace bio-labs | SA-S-1L | |
Benchtop refrigerated centrifuge | Eppendorf | Z605212 | |
Biotin-PEG | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA 5000 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | New England Biolabs | B9001S | |
Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | 31307 | |
cation exchange column | GE healthcare | MonoS (4.6/100) | |
Cell distruptor | Constant Cell Disruption System | TS5/40/CE/GA | |
Coomassie Brilliant Blue | MP Biomedicals | 808274 | |
Cy3 emission filter | Chroma | HQ600/40M-25 | |
Cy5/Alexa Fluor 647 emission filter | Chroma | HQ700/40M-25 | |
Dichroic for DV2 filter cube | Photometrics | 630dcxr-18×26 | |
Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | R0861 | |
Drill | Dremel | 200-1/21 | |
Electronic cutter | Copam | CP-2500 | |
EMCCD camera | Hamamatsu | C9100-13 | |
Epoxy glue | Devcon | 14250 | |
FPLC Aktapurifier UPC 10 | GE Healthcare | 28406268 | |
GelQuant.NET software | biochemlabsolutions.com | Version 1.8.2 | |
GEN1 entry vector | Harvard plasmid repository | HSCD00399935 | |
Glycerol | Sigma Life Science | G5516 | |
green laser (emission 532 nm) | Coherent | Compass 315M-100 | |
Heparin column | GE healthcare | HiTrap Heparin column | |
HEPES | BDH | BDH4162 | |
Image splitter | Photometrics | Dualview (DV2) | |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
Inverted microscope | Olympus | IX81 | |
Isopropyl-ß-D-thiogalactoside (IPTG) | Goldbio. | 12481C100 | |
Laser scanner | GE healthcare | Typhoon Trio | |
LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
Long pass 532nm filter | Semrock | LPD02-532RU-25 | |
Magnesium Chloride | Sigma Life Science | M8266 | |
mPEG | Laysan Bio | mPEG-SVA 5000 | |
Neutravidin | Pierce | 31000 | |
Ni-NTA column | GE healthcare | HisTrap FF | |
NuPAGE 10% Bis-Tris gels | Novex Life technologies | NP0301BOX | |
NuPAGE 10% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NP0302PK2 | |
Origin software | OriginLab Corporation | Version 8.5 | |
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Alexis Biochemicals | 270-184-G025 | |
Phosphate-buffered saline | GIBCO | 14190 | |
Polyethylene Tubing (I.D. 0.76 mm O.D. 1.22mm) | Fisher (Becton Dickinson) | 427416 | |
Protocatechuate 3,4-dioxygenase (3,4-PCD) | Sigma-Aldrich | P8279-25UN | |
Quad-band dichroic | Chroma Inc | Z405/488/532/640rpc | |
red laser (emission 640 nm) | Coherent | Cube 640 100C | |
Sodium Chloride | Fisher Chemical | S271 | |
Sorvall RC-6 plus centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46910 | |
Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000 | |
Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3007 | |
Teflon tweezers | Rubis | K35A | |
Tris Base | Promega | H5135 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-90K | |
Ultrafiltration membrane | Millipore | UFC90300 |