Single-molecuul Förster Resonance Energy Transfer methoden voor real-time onderzoek van de Holliday Junction-resolutie door GEN1

1. voorbereiding van oppervlakte-Gefunctionaliseerde dekstroken Reiniging Plaats vijf dekstroken (24 mm x 60 mm) in ethanol in een Coplin jar. Sonicaat in ethanol dan in 1 M kaliumhydroxide gedurende 30 min voor 3x. Was in aceton 3x dan decant. Silanisatie Bereid een oplossing van 2,8% 3-aminopropyltriethoxysilaan (APTES) in aceton. Sluit de APTES-fles af met een paraffine folie en bewaar deze bij 4 °C.Opmerking: gebruik een veiligheidsbril en werk onder een rook afzuigkap. De container van de silaan-oplossing moet volledig droog en gespoeld worden door aceton onmiddellijk voor en na het gieten van de silaan-oplossing in de pot. Giet 70 mL van de 2,8% APTES-oplossing in de Coplin-pot met de dekstroken. Schud de pot gedurende 4 minuten in een rondschudapparaat. Laat de pot gedurende 5 minuten op de Bank staan, soniceren gedurende 1 minuut en houd de pot tenslotte nog 10 minuten op de Bank om te reageren met de hydroxylgroepen op het glazen oppervlak. Quench de reactie door de toevoeging van 1 L gedeïoniseerd water door water direct in de pot te gieten voor snelle oplosmiddel uitwisseling. Spoel de dia’s 3x in water door zijwaarts schudden van de pot op een vlakke ondergrond. Neem de dekstroken uit de pot en plaats ze op een aluminiumfolie bakje. Bak de dekstroken in een oven bij 110 °C gedurende 30 minuten om de afdek stroken te drogen en de silaan te genezen. Laat de lade op de Bank staan om de dekstroken af te koelen tot kamertemperatuur. PEGylation Verwarm de biotinyleerd Peg en Peg, opgeslagen bij-20 °c tot kamertemperatuur (RT) om condensatie van vocht bij het openen van de container te voorkomen. Plaats vijf dekstroken met het gesilaneerde glaswol oppervlak naar boven op een doos. Plaats twee afdekglas stroken (22 mm x 22 mm) als afstandhouders langs de randen van de gesilaneerde glaswol dekstroken. Eenmaal opgewarmd, maken biotinyated Peg en Peg oplossingen in een verhouding van ~ 1:100 in 1 ml van verse, 0,1 M natriumbicarbonaat oplossing door toevoeging van 1,5 mg biotinyleerd Peg en 150 mg Peg in een 1,5 ml buis. Vortex de buis om te ontbinden PEG en spin naar beneden om luchtbellen te verwijderen.Opmerking: Ga verder vanaf deze stap, wees snel, omdat PEG hydrolyseert in oplossing binnen een tijdschaal van min. Breng 100 μL van de PEG-oplossing snel aan op elke dekslip. Neem nog een gebakken dekglaasje en plaats het bovenste gesilaneerde glaswol oppervlak op de bovenkant van de afdekplaat met de Peg-oplossing, vandaar het vormen van een glas-Solution-Glass sandwich waarin de 22 mm x 22 mm niet-gesilaniseerde dekstroken toestaan dat de twee Gefunctionaliseerde dekstroken gemakkelijk gescheiden worden. Inbroed de afdek stroken ‘s nachts (16 uur) in het donker en bij RT. Zodra de incubatie voltooid is, neem de dekstroken uit elkaar, spoel vervolgens 10x met gedeïoniseerd water door van de zijkant te wassen met een spuitfles. Droog de dekstroken onder een stroom van droge stikstof. Bewaar de droge dekstroken onder vacuüm.Opmerking: de dia’s kunnen worden gebruikt voor 1 maand zonder verslechtering van de kwaliteit. 2. bereiding van de stroomcel Eenkanaals stroomcel Boor twee gaten met een diameter van 1,22 mm in het middelste deel van een kwarts glijbaan (50 mm x 20 mm) met de Centreer punten 37 mm uit elkaar en 6,5 mm van de rand van de glijbaan (Figuur 1a). Knip een 41 mm x 2,25 mm-kanaal in een stuk van een dubbele kleefplaat van 50 mm x 20 mm met behulp van een elektronische frees. Schil de plastic kant van de beschermkap en lijn de randen van het stuk uit met de randen van de kwarts glijbaan. Verwijder ingesloten luchtbellen door zachtjes te drukken met een paar polytetrafluorethyleen pincet. Verwijder de papier zijde van het Kleef stuk. Monteer het stuk op het Gefunctionaliseerde oppervlak van de dekslip. Snijd polyethyleen slang (I.D. 1,22 mm) in een lengte van 11 cm voor de inlaat en 25 cm voor de uitlaat. Plaats de buis in de eerder geboorde gaten als inlaat en uitlaat voor de stroomcel. Gebruik 5 min epoxy lijm om rond de randen van de Quartz-coverslip-interface en rond de buizen voor de inlaat en uitlaat te verzegelen. Gebruik de stroomcel onmiddellijk zodra deze droogt of bewaar onder droog vacuüm voor later gebruik. Los avidin in PBS op tot een concentratie van 0,03 mg/mL. Filter door middel van een spuit filter van 0,2 μm. Stroom avidin in de stroomcel met behulp van een 1 mL spuit. Gebruik een andere spuit gevuld met buffer om overtollige avidin te wassen. Wees voorzichtig om geen luchtbellen te introduceren tijdens het uitwisselen van de spuiten. Meerkanaals stroomcel Boor zes gaten met een diameter van 1,22 mm op elk van de lange zijden van een kwarts glijbaan (76 mm x 25 mm) (Figuur 1b). Maak de gaten 4,5 mm van de rand van de glijbaan en 9,3 mm uit elkaar. Zorg ervoor dat de afstand tussen de centra van elk hole paar 15 mm is. Knip zes kanalen (20 mm x 2,25 mm) in een tweeklevende tape van 76 mm x 25 mm met behulp van de elektronische frees. Schil de plastic kant van de beschermkap en lijn de randen van het lijm stuk uit met de randen van de kwarts glijbaan. Verwijder eventuele ingesloten luchtbellen door zachtjes te drukken met behulp van een paar polytetrafluorethyleen pincet. Verwijder de papier zijde van het Kleef stuk en monteer het op het Gefunctionaliseerde oppervlak van de afdekfolie.Opmerking: soms afbladderen van de papier kant en hechten aan de Quartz Slide werkt goed in de multichannel stroomcel. Knip de inlaatbuizen (11 cm) en de uitlaat buizen (25 cm) voor de zes kanalen. Bereid de stroomcel voor zoals beschreven in stap 2.1.6 – 2.1.9. Sluit de uitlaat van het eerste kanaal aan op de pomp. Plaats de inlaat in een buis van 0,5 mL met OSS.Opmerking: de lengte van de inlaatbuis wordt gekozen om het aantal gebeurtenissen in de splijting experimenten uitgevoerd onder continue stroom te maximaliseren door het synchroniseren van de tijd van enzym ingang in de stroomcel en het begin van de beeldvorming waardoor vroegtijdige fotobleking van de fluorohores. Ga naar een nieuw kanaal door de uitlaat van het gebruikte kanaal los te koppelen. Sluit het stopcontact met een plug die is gemaakt van een injectienaald die is verzegeld met lijm in het kunststof gedeelte. Sluit de inlaat van het gebruikte kanaal. 3. bereiding van het zuurstof ruimings systeem (OSS) Los 0,2 g (±) -6-hydroxy-2, 5, 7, 8-tetramethylchromane-2-carboxylzuur op (triplet State dorstlesser die het knipperen van de fluoroforen minimaliseert) in 800 μL methanol. Voeg 6 ml gedeïoniseerde H2O toe en voeg 1 N NaOH druppelsgewijs toe totdat het oplost. Filtreer door een spuit filter, maak in 1 mL aliquots en bewaar bij-80 °C. De voorraad concentratie is ~ 100 μM. Bereid een nieuwe oplossing van 3, 4-dihroxybenzoinezuur (PCA) door het oplossen van 61 mg PCA-poeder in 4 mL ddH2O. De voorraad concentratie is ~ 100 nM. Voeg 58 μL 10 N NaOH dropwise toe, zorg ervoor dat u na elke druppel een Vortex maakt totdat de PCA volledig is opgelost (pH = 9). Los 5,3 mg protocatechuate 3, 4-dioxygenase (3, 4-PCD) op in 7 mL opslag buffer voor PCD (tabel 1). 3, 4-PCD verwijdert zuurstof uit de binding/splijting buffers door het katalyseren van de oxidatie van protocatechuïnezuur acid34. Verdeel de PCD-oplossing in 1 mL aliquots. De voorraad concentratie is ~ 1 μM. Klik in de vriezer om de aliquots in vloeibare stikstof te bevriezen en bewaar bij-80 °C voor langdurige opslag of bij-20 °C voor korte-termijn opslag. Bereid een nieuwe bindings buffer (tabel 1). Vervang 2 mM CaCl2 met 2 mm MgCl2 voor smfret decolleté experimenten. Bereid 1 mL van de beeldvormings buffer (tabel 1). Houd de beeldvormings buffer op ijs totdat deze in de stroomcel wordt ingebracht om de activiteit van het zuurstof opruimingssysteem te behouden. 4. bereiding van fluorescently gelabelde HJs Reconstitueer de gelyofiliseerde oligos (tabel 2) in tris-EDTA-buffer (tabel 1) tot een concentratie van 100 μM. Bereid de synthetische kruising door equimolaire porties te mengen ~ 3 μL van elk van de X0 oligos die in tabel 1worden vermeld. Anneal door verwarming bij 95 °C gedurende 5 minuten gevolgd door langzame koeling tot RT met een snelheid van 1 °C/min. gebruik een warmte blok of PCR-Thermocycler om de gewenste koelsnelheid te bereiken. Laad het mengsel op 8 cm x 8 cm van 10% tris-borate-EDTA polyacrylamidegel. Breng 100 V aan en voer de gel uit voor ~ 2 uur. De bands worden duidelijk gezien door het oog, en hun kleur is paars. Accijns de band van het gegloeide substraat met een schoon blad. Breng het gelstuk over in een geautoclaveerd 1,5 mL Tube. Plet het gelstuk in de buis met een schone zuiger en voeg vervolgens 100 μL TE100-buffer (tabel 1) toe. Pak de HJ door schudden van de buis bij 20 ° c bij 1.500 rpm in een thermomixer voor ~ 2 h of inincuberen ‘s nachts bij 4 ° c. Voer ethanol precipitatie uit op de oplossing die het substraat35bevat. Breng de ondergrond in 20 μL TE100 buffer uit (tabel 1). De uiteindelijke concentratie is 1–3 ΜM. aliquot 2 μL in elke buis en bewaren bij-20 °c. 5. eiwit expressie en zuivering van GEN1 Bouw het plasmide voor de uitdrukking van afgeknotte menselijke GEN11,2,3,4,5 met hexa histidine-tag aan de C-Terminus20 door PCR van de ingangs vector.Opmerking: N-Terminal tagging zou resulteren in de inactivatie van GEN1. De ongestructureerde C-tail maakt de zuivering van de volledige lengte GEN1 aanzienlijk moeilijker. Ook is de volledige lengte GEN1 gerapporteerd aan minder activiteit dan afgekapt versie23vertonen. Transformeer de expressie vector in E. coli BL21-codonplus (DE3)-ripl stam. De getransformeerde cellen worden in twee kolven van 6 l geënt, elk met 2 l Luria Bouillon-media bij 37 °c, met een schud snelheid van 180 rpm tot een od600 van 0,8 is bereikt. Koel de cultuur af tot 16 °C en induceren GEN1 expressie met 0,1 mM Isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) voor 48 h. Oogst de cellen door ze te spinnen bij 4 °C bij 1000 x g in een centrifuge. Elke liter cultuur levert 5–6 g van de pellet. Gooi de supernatant weg en regeer de cellen met pellets in de lysisbuffer (tabel 1) met 4 ml/g cellen. Voer celllysis uit met behulp van een cel disruptor bij 30 kPsi en spin vervolgens op 10.000 x g gedurende 1 uur bij 4 °c. Verzamel het supernatant en filtreer het op ijs met behulp van 0,45 μm filters. Voer met FPLC een eiwit zuivering uit door het filtraat door te geven via een 5 mL ni-NTA-kolom met een debiet van 2,5 ml/min met buffer A (tabel 1). Wassen met 15 kolom volumes (CV). Elute met een lineaire gradiënt van buffer A en 500 mM imidazol over 20 CV in fracties van 5 mL. GEN1 kolom uit de kolom rond 100 mm imidazol. Pipetteer 10 μL aliquots uit de verzamelde fracties, voeg gelijk volume van 2x SDS loading Dye toe aan elk aliquot. Denature de monsters door te verwarmen bij 90 °C gedurende 5 min, koel, en draai de monsters. Laad de monsters op 10% bis-tris gel. Voer de gel 30–45 min op 200 V. vlek met behulp van Coomassie Brilliant Blue, dan destain. Verzamel de fracties die gezuiverde GEN1 bevatten. Verminder de zoutconcentratie van de gecombineerde fracties tot 100 mM door verdunning met behulp van buffer C (tabel 1). Geef het lage zout eiwit door een 5 mL heparine kolom met een debiet van 3 mL/min met buffer B (tabel 1). Wassen met 10 CV. Elute met een helling van 20 CV met buffer B en 1 M NaCl. Verzamel 5 mL fracties waarin GEN1 rond 360 mM NaCl. Controleer de elerefracties voor gezuiverde GEN1 fracties zoals beschreven in stap 5,8. Combineer die fracties en Verdun tot 100 mM NaCl met behulp van buffer C. Laad het onderste zout eiwit op een kationen wisselingskolom bij 1 mL/min stroomsnelheid met buffer B. Elute door een helling van 40 CV met buffer B en 1 M NaCl. Verzamel 1,7 ml fracties in welke GEN1 kolom rond 300 mm NaCl. Controleer de zuiverheid van GEN1 in de elerefracties zoals beschreven in stap 5,8. Combineer de zuiverste fracties en dialyze bij 4 °C tegen opslag buffer (tabel 1). Ten minste één uitwisseling van de buffer tijdens dialyse uitvoeren. Meet de eiwitconcentratie ~ 0,5–1 mg/ml. Aliquot het dialyzed eiwit in 10–15 μL in kleine buisjes, in vloeibare stikstof, en bewaar bij-80 °c. 6. single-molecule FRET experimenten Opmerking: de smFRET-experimenten worden uitgevoerd op een op maat gemaakte objectief gebaseerde TIRF-opstelling (figuur 1c) die eerder werd beschreven31. Single-Color FRET experimenten Breng één druppel Dompel olie aan op de 100x TIRF-doelstelling. Stel de EMCCD in op een geschikte versterking om het signaal naar de achtergrond te optimaliseren en verzadiging te voorkomen.Opmerking: kijk niet direct in de laserstraal en draag een beschermende bril bij het uitlijnen van de laser. Plaats de stroomcel voorzichtig op de monsterhouder. Verhoog geleidelijk het doel met behulp van grove aanpassing totdat de olie de dekslip raakt. Zet de groene laser aan (532 nm). Overschakelen naar de modus voor fijnafstelling van de doelstelling. Directe de emissie naar de camera poort om het beeld op de monitor te observeren. Pas de hoogte van de doelstelling aan totdat het Gefunctionaliseerde oppervlak van de Afdeklijst scherp wordt gesteld en op de monitor kan worden waargenomen.Opmerking: de beeld verwerving door EMCCD activeert de laser excitatie via het acousto-optische instelbare filter (AOTF) om fotobleking van het monster te voorkomen wanneer beelden niet worden verkregen. Controleer of de achtergrond van het Gefunctionaliseerde oppervlak van de dekstroken niet meer dan enkele vlekken overschrijdt voordat deze in het fluorescently label HJ stroomt. Verdun het voorraad substraat ongeveer 1000 keer in TE100 buffer (tabel 1) tot een eindconcentratie van 1 – 5 nm. Pipetteer 0,2 – 0,5 μL van het verdunde substraat in 120 μL van de beeldvormings buffer met OSS in een buis van 0,5 mL. Sluit de uitlaat van de stroomcel aan op de pomp van de spuit. Steek de inlaatbuis van de stroomcel in de buis van 1,5 mL en bedien de spuitpomp met een debiet van 30 – 50 μL/min om de oplossing uit de buis te trekken. Controleer regelmatig het oppervlak voor een goede dekking (100 – 300 van homogenously verdeelde, goed verdeelde ondergrond) door een korte beeldvorming met de groene laser. Als de dekking van het oppervlak nog steeds niet voldoende is, wacht dan enkele minuten tot het fluorescently label HJ van de oplossing om zich op het oppervlak te vestigen of herhaal de vloeiende stap. Stroom nog eens 120 μL van de beeldvormings buffer (tabel 1) bij 30 – 50 μL/min om niet-afhankelijke fluorescently met het label HJ te wassen. Laat vervolgens de stroomcel 5 minuten zitten, zodat de OSS opgeloste zuurstof kan afbreken. De fotobleking van de fluor Foren moet bij aanvang van de beeldvorming minimaal zijn. Stel de belichtingstijd (~ 60 MS) in, de cyclustijd wordt automatisch ingesteld door software op basis van de snelheid van de gegevensoverdracht (~ 104 MS) en specificeer het gewenste aantal cycli of frames (~ 400). De emissie van donor (Cy3) en acceptor (Alexa Fluor 647) is opgesplitst in twee kleurkanalen door een beeld splitter apparaat. Zoek een geschikt gebied op het oppervlak, concentreer de afbeelding door de hoogte van de doelstelling aan te passen en de film in een 16-bits TIFF-indeling te registreren en op te slaan. Naar een nieuw gebied verplaatsen.Opmerking: Beweeg altijd in één richting (d.w.z. van de uitlaat naar de inlaat) om Imaging niet hetzelfde gebied tweemaal te vermijden. Bereid 1, 2, 5, 10, 25, 50, 75 en 100 nM GEN1 in 120 μL van de beeldvormings buffer een voor een. Debiet van de oplossing met een debiet van 30-50 μL/min.Opmerking: als de vereiste meting wordt uitgevoerd onder steady state als in de binding van HJ door GEN1 of de isomerisatie van de gratis HJ, wacht dan 3 – 5 min na de stroom stopt om de film op te nemen. Verwerven van drie tot vier films uit nieuwe gebieden voor elke GEN1-concentratie. Als de meting wordt uitgevoerd onder continue stroom als in splitsing van HJ door GEN1 Start opnemen 5 – 10 s voor de ingang van GEN1 in de stroomcel. Herhaal de meting door naar een nieuw kanaal in de stroomcel met zes kanalen te gaan. Aan het einde, gebruik een vaste fluorescerende kraal dia om de donor en acceptor deeltjes aan elkaar in de afbeelding splitsings apparaat. Voeg 0,2 μL fluorescerende kralen met een diameter van 1 μm toe aan 500 μL van 1 M Tris (pH = 8,0), zodat de parels aan het oppervlak kunnen blijven plakken. Snijd een vierkant (18 mm x 18 mm) binnen een 22 mm x 22 mm stuk van een dubbelzijdige Kleef zegel. Schil het stuk en plak het in het midden van een kwarts glijbaan van 76 mm x 25 mm. Plaats 50 μL van de verdunde kralen oplossing en laat 5 – 10 min. om zich te vestigen. Bevestig een 22 mm x 22 mm afdek bovenop het vierkante stuk. Droge overtollige kralen oplossing met weefsel, dan verzegelen de kamer met epoxy lijm. Verkrijg 100 frames van de kralen glijbaan bij een 60 MS belichtingstijd.Let op: verlaag het Laser vermogen en de EMCCD Gain tot een minimum om verzadiging van de detector te voorkomen. Installeer het softwarepakket (bijv. Twotonen) en open de daarin opgenomen films zoals aangegeven in de gebruikershandleiding36. Selecteer de posities van de individuele kralen in de donor-en accepterende kanalen. Genereer een transformatie matrix zoals beschreven in de handleiding.Opmerking: deze software gebruikt transformatie matrix om de posities van de deeltjes in de donor-en accepterende kanalen te matchen en om een lichte afwijking in het beeld splitsings apparaat te corrigeren. Ga naar bestand, druk op film laden, Selecteer het filmbestand en druk op Open. Druk in het menu bestand op Load TFORM en selecteer de transformatie matrix die is gegenereerd op basis van de Beads-dia. Pas de drempel voor de kanalen van de donor en acceptor aan totdat er geen valse positieven zijn opgenomen. Kies in het menu kanaal filter D & & een optie om te selecteren voor deeltjes die zijn gelabeld met zowel de donor als de acceptor. Controleer het dichtstbijzijnde neighbor Limit-veld om moleculen uit te sluiten die dicht bij elkaar liggen. Vink Max ellipsiteit aan om zeer excentrische moleculen uit te sluiten en de breedte limieten te controleren om zeer brede of zeer nauwe moleculen uit te sluiten. Typ Plothistcw zoals geïnstrueerd in twotones Manual om histogrammen te construeren.Opmerking: de “schijnbare” FRET-efficiëntie wordt berekend door het programma door de emissie van de acceptor te delen door de totale emissies van de donor en acceptor. Twotones gebruikt 100 intervallen om de verdeling van de toestanden van de moleculen tegen de FRET-efficiëntie te bin- Typ Plottimetracecw zoals geïnstrueerd in Twotones handleiding voor het genereren van de tijd-traces voor elk molecuul.Opmerking: tijd sporen kunnen verder worden geanalyseerd door vbFRET37 om verschillende fret-toestanden, hun respectieve verblijfs tijden en overgangs snelheden tussen verschillende statussen te identificeren. Experimenten met twee kleuren voor afwisselend excitatie FRET (ALEX) Neem een film op die bestaat uit opeenvolgende frames van donor-en accepterende emissies door directe excitaties met respectievelijk de groene en rode lasers, elk ~ 80 MS in duur. Open de verworven ALEX-films in Twotones. Stel de geschikte detectiedrempel in als ~ 300 voor de drie kanalen: donor emissie als gevolg van donor excitatie (DexDem); afgifte van acceptor door donor excitatie (DexAem); en accepterende emissie door directe excitatie (AexAem). Pas het kanaal filter DexDem & & DexAem & & AexAem toe om te selecteren voor de deeltjes die zowel de donor als de acceptor hebben. Koppel de deeltjes ~ 200 – 300 in de drie kanalen. Gebruik de plotHistALEX MATLAB code om ALEX histogrammen te genereren. Passen verschillende pieken in de histogrammen aan Gaussiaanse functies en bepaal het percentage van elke populatie het gebied onder de curve met behulp van Origin software38.Opmerking: de pieken in de bindende assay corresponderen met de afhankelijke GEN1-HJ complex, terwijl in de gratis HJ, de pieken vertegenwoordigen de verwisseling van de isomeren. Gebruik de Plottimetracealex MATLAB-code om een tijds tracering te genereren voor elk molecuul dat de donor emissie weergeeft door middel van directe excitatie, en accepterende emissies als gevolg van fret en direct excitatie.Opmerking: ALEX time-traceert zelfstandig om de uitstoot van zowel de donor als de acceptor te laten zien, maar met een lagere temporele resolutie dan single-Color FRET. Net als bij single-Color FRET, kan ALEX time-traces verder worden geanalyseerd door vbFRET om verschillende FRET toestanden en hun respectieve verblijfs tijden te identificeren. Bepaal de Dissociatieconstante door de percentages van de gebonden populatie versus de GEN1-concentratie te monteren op een hyperbolische functie. Time lapse single-Color FRET Stel de belichtingstijd van de groene laser in op 60 MS en cyclustijd tot 624 MS of lager, afhankelijk van de snelheid van de waargenomen dynamiek. Stel de stroomsnelheid in op 110 μL/min in één kanaal van de zeskanaalstroomcel. Start de opname kort voor de ingang van GEN1 in de stroomcel.Opmerking: continue stroom leidt tot snelle fotobleking van de fluoroforen, waardoor het begin van de opname van Imaging en proteïne wordt gesynchroniseerd, maximaliseert het aantal vastgelegde gebeurtenissen. De optimale aflezing van de spuitpomp is afhankelijk van het dode volume en de exacte slang die wordt gebruikt om de stroomcel te monteren; in ons geval is het ~ 25 μL. Verkrijg een film van ~ 125 frames voor een totale acquisitie tijd van 78 s. Aan het einde van de opname, bloot het monster aan de rode laser voor 50 frames elk met 25 MS belichtingstijd om de acceptor te sonde.Opmerking: deze methode verlengt het observatie venster in decolleté experiment door het verminderen van het aantal excitatie cycli. Kinetische parameters als kop en koff van de door dimerisatie worden afgeleid door het monteren van de verdeling naar een bi-exponentiële model30,38. 7. elektroforetisch mobiliteits verschuiving assays (EMSA) In 50 μL totaal volume, incuberen de gewenste concentratie van GEN1 met 50 pM Cy5-gelabelde HJ bij RT voor 30 min in EMSA bindings buffer (tabel 1). Laad de monsters op 8 cm x 8 cm van 6% tris-borate-EDTA gel. Voer de gel uit met 100 V voor 1 h + 20 min in 1x TBE buffer op RT. Bepaal het percentage gebonden substraat bij een GEN1-concentratie van zijn relatieve bijdrage aan de totale fluorescentie intensiteit van de respectieve rijstrook.Opmerking: GEN1 monomeer-HJ (band I) wordt geïdentificeerd door de overeenkomst van zijn grootte met de picomolaire binding van GEN1 monomeer aan de verkreukeld HJ21,30. Gen1-dimer-HJ is toegewezen aan band II vanwege de stapsgewijze binding van GEN1 monomeer aan de HJ21,23. Bereken de schijnbare bindings constanten Kd-monomeer-app-EMSA en Kd-dimer-app-EMSA met behulp van de vergelijking:Waar: Max de concentratie is waarbij de respectieve soorten zijn maximale binding bereikten (monomeer of dimeer); n = de heuvel coëfficiënt; K d-app-EMSA is de schijnbare bindende constante van de respectieve soorten, die de concentratie van GEN1 aangeeft waarbij het halve maximum van monomeer of dimeer aanwezig is.