Представлен протокол для выполнения одномолекулярной рецензной передачи энергии Фюрстера для изучения разрешения HJ. Двухцветные переменные возбуждения используется для определения констант диссоциации. Одноцветный промежуток времени smFRET затем применяется в анализах расщепления в режиме реального времени, чтобы получить распределение времени пребывания до разрешения HJ.
Массовые методы измеряют ансамбльное поведение молекул, в которых индивидуальные показатели реакции основных шагов усредняются по всей популяции. Одномолекулярная ремолекула Фюрстерской рецензной передачи энергии (smFRET) обеспечивает запись конформанформивальных изменений, происходящих отдельными молекулами в режиме реального времени. Таким образом, smFRET является мощным в измерении структурных изменений в ферменте или субстрате во время связывания и катализа. Эта работа представляет собой протокол для одномолекулярной визуализации взаимодействия четырехсторонней коллидейской развязки (HJ) и зазорной эндонуклеазы I (GEN1), цитосоликического гомолегаричного фермента рекомбинации. Также представлены одноцветные и двухцветные переменные возбуждения (ALEX) smFRET экспериментальных протоколов следовать резолюции HJ GEN1 в режиме реального времени. Кинетика димеризации GEN1 определяется в HJ, который, как было предложено, играет ключевую роль в разрешении HJ и остается неуловимым до сих пор. Описанные здесь методы могут быть широко применены для получения ценных механистических идей многих ферментно-ДНК-систем.
Одномолекулярные методы, основанные на обнаружении флуоресценции, обеспечивают высокое соотношение сигнала к шуму1. FRET является спектроскопической техникой, которая может измерять расстояния в диапазоне 1-10 нм, делая этот метод молекулярным линейкой для измерения расстояний в диапазоне нанометров2,3. Спектр поглощения принимает частичное спектральное совпадение со спектром выбросов донора на более коротком конце волны. FRET опосредовано передачей энергии без излучения между парой донора и принимающего, в то время как эффективность передачи энергии зависит от расстояния и ориентации принимающего4.
Было реализовано несколько подходов, чтобы свести к минимуму фон и повысить эффективность обнаружения сигнала флуоресценции5,6. Одним из подходов является конфокальная микроскопия, в которой пинхол ограничивает место возбуждения размером ниже предела дифракции7. Другим подходом является тотальная внутренняя флуоресценция отражения (TIRF), которая представляет собой широкополевой метод освещения, в котором свет направлен вне оси выше критического угла8. Свет затем полностью внутренне отражается на интерфейсе между стеклом и водным раствором, генерируя эвакуационную волну, которая освещает флюорофоры, прикрепленные к стеклянной поверхности, и предотвращает фон от флюорофоров в остальной части решение.
В конфокальной микроскопии молекулы могут быть либо свободно рассеяны, либо обездвижены на поверхности. Достигнутое временное разрешение может быть в пределах микросекунд до нескольких миллисекунд9. Конфоккодное обнаружение для одной молекулы осуществляется однофотональным лавинным диодом (SPAD) и точечное сканирование области, представляющим интерес10. В TIRF, временные ряды из нескольких сотен молекул, обездвиженных на поверхности, регистрируется позиционно-чувствительным двухмерным детектором заряда (CCD). CCD усиливает сигнал флуоресценции либо за счет усиленного фосфорного экрана и микроканальной пластины, либо помножения фотоэлектронов на чипе (EMCCD). Временное разрешение зависит от скорости считывания и квантовой эффективности CCD и обычно на порядка нескольких десятков миллисекунд6.
HJ является центральным промежуточным в реабире ДНК и рекомбинации11,12,13,14. HJ имеет две непрерывные и две пересекающиеся нити, которые соединяются между непрерывными нитями, не пересекаясь друг с другом. HJ существует в решении как X-штабированные конформисты, которые проходят непрерывную изомеризацию непрерывными стренгами, становясь скрещиваниями, а стыковки становятся непрерывными в другом конформате15. Изомер предпочтения HJ зависит от основной последовательности и ионной среды и был широко изучен FRET16,17,18,19.
GEN120 является мономерным белком в растворе21 и требует димеризации, чтобы расщеплять HJ, что позволяет правильное разделение рекомбинированных нитей22,23. Укладка конформат предпочтения HJ влияет на результат генетической рекомбинации, установив ориентацию резолюции HJ resolvases24. Понимание того, как GEN1 связывает HJ, координирует два разреза, и обеспечивает его полное разрешение все были в интенсивномисследовании21,22,23,25,26 ,27,28,29,30.
В этом исследовании используется объективная настройка TIRF, как описано ранее31. Двухцветные переменные возбуждения (ALEX) применяется для определения конформационных изменений при взаимодействии GEN1 с флюорофором помечены HJ. ALEX производит 2D гистограммы на основе двух соотношений FRET эффективности E, которая является донором-приемщиком расстояния зависит, и stoichiometry параметр S, который измеряет донора-приемного stoichiometry32. ALEX позволяет сортировать флуоресцентные виды на основе стоихиометрии флюорофоров, включая только донора, только принимать, и смешанные субпопуляции. ALEX может расширить использование FRET в полном диапазоне и может обнаружить различия в яркости флюорофора и олигомеризации, а также контролировать макромолекулы-лиганд взаимодействия33.
Установлено, что GEN1 последовательно успешно решает Проблему HJ в течение всего срока службы комплекса GEN1-HJ. Зависящие от времени конформационные изменения происходят из временных следов отдельных молекул, в то время как гистограммы представляют распределение основных популяций. С использованием замедленного одноцветного FRET, быстрые на-ставки и медленные off-тарифы для GEN1 димер продемонстрированы, которые увеличивают сродство собранного GEN1 dimer на первом продукте разреза.
В этом исследовании были внедрены различные методы smFRET для определения кинетики разрешения HJ GEN130. Аналогичные подходы smFRET были использованы для выполнения двойного клапана ДНК конформационного требования и расщепления репликации ДНК и ремонта клапана эндонуклеаза 142,43,44. Здесь обсуждаются критические шаги в этом протоколе. Реакция силанизации должна быть свободна от любых следов влажности. Решение пегилации следует быстро применять к силанизированному стеклу после растворения ПЭГ, чтобы избежать гидролиза. В многоканальной ячейке потока любой захваченный воздух в клейом листе должен быть удален, чтобы избежать утечки между соседними каналами. Раствор PCA должен быть свежеприготовлен, так как он окисляется с течением времени. Добавление 10 N NaOH должно быть dropwise, с вихрем между ними. Фон флуоресценции в крышке должен быть минимальным, прежде чем течь флуоресцентно помечены HJ. Изображение в ячейке потока должно быть выполнено в одном направлении, чтобы избежать отбеленных изображений областей. В экспериментах ALEX, сила красного лазера должна быть уменьшена, чтобы избежать быстрого отбеливания приемного. В экспериментах замедленного времени время цикла должно быть короче, чем самое быстрое событие.
smFRET является чувствительным методом, который может обеспечить ценную информацию в режиме реального времени в биомолекулярных реакциях. Тем не менее, этот метод имеет ряд технических проблем, среди которых является достижение измеримых изменений в FRET во время биохимической реакции. Это необходимо для того чтобы получить well-separated характеристики в гистограммах и различимых положениях в следах времени. Во многих случаях smFRET требует тщательного проектирования субстратов, выбора пар фторофора и их позиций, а также усиления изменений FRET в субстрате ДНК из-за незначительного структурных изменений в субстрате45. Другой подход для выполнения FRET заключается в использовании помеченных белков46. Окно наблюдения в FRET ограничено стабильностью приемного, такого как Cy5 или Alexa Fluor 647, который имеет тенденцию к отбеливанию быстрее, чем донор (Cy3 в данном случае). Таким образом, FRET требует постоянного поиска стабильных фторофоров, чтобы продлить продолжительность эксперимента и усилия по разработке систем очистки кислорода, чтобы продлить сигнал флуоресценции и максимизировать соотношение сигнала к шуму47,48 .
Среди советов по устранению неполадок в smFRET является балансирование нескольких параметров, участвующих в визуализации, таких как мощность лазера, время экспозиции, время цикла, и количество циклов, чтобы максимизировать выброс флуоресценции, продлить продолжительность эксперимента, и достичь соответствующие интервалы отбора проб для динамики ферментов. Более длительное время наблюдения и минимальные эффекты от фотоотбелевания имеют важное значение для получения высокой точности осязать распределение времени, которые представляют динамику фермента. ALEX генерирует лучшие гистограммы, так как этот метод подвергается более низкому вкладу от фотоотраблированных частиц по сравнению с одноцветной FRET. Тем не менее, временное разрешение в ALEX ниже, чем в одноцветных FRET.
Наконец, акцент smFRET на обнаружение конформационных/структурных изменений в отдельных молекулах в режиме реального времени преодолевает разрыв между структурными методами высокого разрешения (т.е. рентгеновская кристаллография, ядерный магнитный резонанс, электронная микроскопия), которая обеспечивает структурное разрешение атомного разрешения в статических условиях и методах, которые дают среднему ансамблю измеримое свойство. Во многих аспектах smFRET зарекомендовал себя как мощный метод изучения биологических систем в режиме реального времени.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Университетом науки и техники короля Абдаллы через основное финансирование и премию за конкурентные исследования (CRG3) С.М.Х.
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) | Sigma-Aldrich | 238813 | |
0.1 M sodium bicarbonate buffer | Fisher | 144-55-8 | |
10 % Novex Tris-Borate-EDTA gel | Thermo Fisher Scientific | EC6275BOX | |
100 X TIRF objective | Olympus | NAPO 1.49 | |
3,4-dihroxybenzoic acid (PCA) | Sigma-Aldrich | P5630 | |
3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | 741442 | |
6% Novex Tris-Borate-EDTA gel | Thermo Fisher Scientific | EC6265BOX | |
Adhesive sheet | Grace bio-labs | SA-S-1L | |
Benchtop refrigerated centrifuge | Eppendorf | Z605212 | |
Biotin-PEG | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA 5000 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | New England Biolabs | B9001S | |
Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | 31307 | |
cation exchange column | GE healthcare | MonoS (4.6/100) | |
Cell distruptor | Constant Cell Disruption System | TS5/40/CE/GA | |
Coomassie Brilliant Blue | MP Biomedicals | 808274 | |
Cy3 emission filter | Chroma | HQ600/40M-25 | |
Cy5/Alexa Fluor 647 emission filter | Chroma | HQ700/40M-25 | |
Dichroic for DV2 filter cube | Photometrics | 630dcxr-18×26 | |
Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | R0861 | |
Drill | Dremel | 200-1/21 | |
Electronic cutter | Copam | CP-2500 | |
EMCCD camera | Hamamatsu | C9100-13 | |
Epoxy glue | Devcon | 14250 | |
FPLC Aktapurifier UPC 10 | GE Healthcare | 28406268 | |
GelQuant.NET software | biochemlabsolutions.com | Version 1.8.2 | |
GEN1 entry vector | Harvard plasmid repository | HSCD00399935 | |
Glycerol | Sigma Life Science | G5516 | |
green laser (emission 532 nm) | Coherent | Compass 315M-100 | |
Heparin column | GE healthcare | HiTrap Heparin column | |
HEPES | BDH | BDH4162 | |
Image splitter | Photometrics | Dualview (DV2) | |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
Inverted microscope | Olympus | IX81 | |
Isopropyl-ß-D-thiogalactoside (IPTG) | Goldbio. | 12481C100 | |
Laser scanner | GE healthcare | Typhoon Trio | |
LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
Long pass 532nm filter | Semrock | LPD02-532RU-25 | |
Magnesium Chloride | Sigma Life Science | M8266 | |
mPEG | Laysan Bio | mPEG-SVA 5000 | |
Neutravidin | Pierce | 31000 | |
Ni-NTA column | GE healthcare | HisTrap FF | |
NuPAGE 10% Bis-Tris gels | Novex Life technologies | NP0301BOX | |
NuPAGE 10% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NP0302PK2 | |
Origin software | OriginLab Corporation | Version 8.5 | |
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Alexis Biochemicals | 270-184-G025 | |
Phosphate-buffered saline | GIBCO | 14190 | |
Polyethylene Tubing (I.D. 0.76 mm O.D. 1.22mm) | Fisher (Becton Dickinson) | 427416 | |
Protocatechuate 3,4-dioxygenase (3,4-PCD) | Sigma-Aldrich | P8279-25UN | |
Quad-band dichroic | Chroma Inc | Z405/488/532/640rpc | |
red laser (emission 640 nm) | Coherent | Cube 640 100C | |
Sodium Chloride | Fisher Chemical | S271 | |
Sorvall RC-6 plus centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46910 | |
Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000 | |
Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3007 | |
Teflon tweezers | Rubis | K35A | |
Tris Base | Promega | H5135 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-90K | |
Ultrafiltration membrane | Millipore | UFC90300 |