GEN1によるホリデイ接合分解能のリアルタイム調査のための単分子フェルスター共鳴エネルギー伝達法

1. 表面機能カバースリップの準備 クリーニング コプリンの瓶の中にエタノールに5つのカバーリップ(24 mm x 60 mm)を入れます。エタノールで30分間水酸化カリウムを1Mで30分間ソニケートする。アセトン3xで洗浄し、その後デカント。 サイラ化 アセトン中に2.8%3-アミノプロピルトリエトキシシラン(APTES)の溶液を調製する。APTESボトルをパラフィンフィルムで密封し、4°Cに保管してください。注:安全ゴーグルを使用し、ヒュームフードの下で作業します。シラン溶液の容器は、シラン溶液を瓶に注ぐ直前と直後にアセトンで完全に乾燥し、すすいでください。 カバースリップを含むCoplinの瓶に2.8%のAPTES溶液の70 mLを注ぎます。軌道シェーカーで4分間瓶を振ります。 瓶を5分間ベンチに置き、1分間超音波処理し、最後にシランがガラス表面のヒドロキシル基と反応するために、さらに10分間ベンチに瓶を置きます。 迅速な溶媒交換のために瓶に直接水を注ぐことにより、脱イオン水の1Lを添加して反応をクエンチする。平らな表面に瓶を横に振ることによって水中でスライド3倍をすすいでください。 カバーを瓶から取り出し、アルミホイルトレイの上に置きます。カバースリップを110°Cのオーブンで30分間焼き、カバースリップを乾燥させ、シランを治します。カバーが室温まで冷却するために、トレイをベンチに置いておきます。 ペギレーション ビオチニル化PEGおよびPEGを温め、-20°Cで室温(RT)に保存し、容器を開けた時の水分の凝縮を防ぎます。 5つのカバーリップを箱の上に向けたシラン化された表面で置きます。2つのカバーガラススリップ(22 mm x 22 mm)を、シラミ化されたカバースリップの端に沿ってスペーサーとして配置します。 温めたら、1mLの新鮮な0.1M重炭酸ナトリウム溶液で約1:100の割合でビオチン化PEGおよびPEG溶液を作り、1.5 mLチューブに1.5mgのバイオチン化PEGと150mgのPEGを加えます。 PEGを溶解し、気泡を除去するためにスピンダウンするチューブを渦。注:PEGは、分のタイムスケール内の溶液中で加水分解するので、このステップから進みます。 各カバースリップに100 μLのPEG溶液を素早く適用します。別の焼きカバースリップを取り、PEGソリューションでカバースリップの上にその上のシラン化された表面を下向きに置き、したがって、22ミリメートルx22ミリメートルの非シラン化カバーリップを可能にするガラス溶液ガラスサンドイッチを形成し、2つの機能化されたカバースリップを可能にします簡単に分離される。 暗闇の中で一晩(16時間)カバーリップをインキュベートします。インキュベーションが完了したら、カバースリップを分解し、ホヤボトルで側面から洗浄することにより、脱イオン水を使用して10倍をすすいでください。 乾燥窒素の流れの下でカバースリップを乾燥させます。ドライカバーを真空下に保管してください。注:スライドは、品質の低下することなく、1ヶ月間使用することができます。 2. フローセルの調製 単一チャネルフローセル 石英スライド(50 mm x 20 mm)の中央部分に直径 1.22 mm の 2 つの穴を開け、中心はスライドの端から 37 mm 離れ、スライドの端から 6.5 mm 離れています(図 1A)。 電子カッターを使用して、41 mm x 2.25 mm チャネルを 50 mm x 20 mm の二重粘着シートに切り取ります。 保護カバーのプラスチック側を剥がし、石英スライドのエッジにピースの端を合わせます。ポリテトラフルオロエチレンピンセットで穏やかに押すことによって、閉じ込められた気泡を取り除きます。 粘着部分の紙側をはがします。カバースリップの機能面にピースを取り付けます。 ポリエチレンチューブ(I.D.1.22 mm)を入口用に11cm、出口に25cmの長さにカットします。フローセルの入口と出口として、以前に掘削された穴にチューブを挿入します。 5分のエポキシ接着剤を使用して、石英カバースリップインターフェイスの端と入口と出口のチューブの周りをシールします。 乾燥した状態になったら直ちにフローセルを使用するか、乾燥真空下に保管して後で使用してください。 0.03 mg/mLの濃度にPBSでアビジンを溶解します。0.2 μmの注射器フィルターを通してフィルターを出す。 1 mL注射器を用いて流れセルにアビジンを流します。余分なアビジンを洗い流すためにバッファで満たされた別の注射器を使用してください。注射器を交換する間、気泡を導入しないように注意してください。 マルチチャネルフローセル 石英スライド(76 mm x 25 mm)の各側に直径 1.22 mm の 6 つの穴をドリルします (図 1B)。スライドの端から穴を4.5mm、9.3mm離します。各穴ペアの中心間の距離が15mmであることを確認します。 電子カッターを使用して、6つのチャンネル(20 mm x 2.25 mm)を 76 mm x 25 mm の二重粘着テープに切り取ります。 保護カバーのプラスチック側を剥がし、接着剤片の端を石英スライドの端に合わせます。ポリテトラフルオロエチレンピンセットを使用して穏やかに押すことによって、任意の閉じ込められた気泡を削除します。 接着剤片の紙側を剥がし、カバースリップの機能化面に取り付けます。注:紙側を剥がして石英スライドに取り付けることは、マルチチャンネルフローセルでうまく機能する場合があります。 6チャンネルの入口管(11cm)と出口管(25cm)を切ります。手順 2.1.6 ~ 2.1.9 で説明するようにフロー セルを準備します。 最初のチャンネルの出口をポンプに接続します。入り込みはOSSで0.5 mLチューブに入れます。注:流入管の長さは、酵素の流入時間をフローセルに同期し、イメージングの開始によって連続的な流れの下で行われる切断実験の事象の数を最大化するために選択され、したがって、早期の光漂白を減少させる蛍煙管。 使用するチャンネルのコンセントを切断して、新しいチャネルに移動します。プラスチック部分に接着剤で密封された注射器針から作られたプラグでコンセントを閉じます。使用するチャネルの入り込み情報を閉じます。 3. 酸素清掃システム(OSS)の準備 メタノールの0.2g(±)-6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テトラメチルクロマン-2-カルボキシリン酸(フッ素の点滅を最小限に抑えるトリプレット状態クエンチャー)を800μLのメタノールで溶解します。 脱イオンH2Oの6 mLを追加し、溶解するまで1 N NaOHを滴下に加えます。注射器フィルターを通してフィルターを通し、1 mLのアリコートにし、-80°Cで保存します。ストック濃度は~100μMです。 ddH2Oの4 mLに61mgのPCA粉末を溶解することにより、3,4-ジロキシ安息香酸(PCA)の新鮮な溶液を調製する。ストック濃度は~100nMです。 10 N NaOHの58 μLを滴下に加え、PCAが完全に溶解するまで各滴の後に渦を作るようにします(pH = 9)。 PCD貯蔵バッファーの7 mLにプロトカテチュエート3,4-ジオキシゲナーゼ(3,4-PCD)の5.3mgを溶解する(表1)。3,4-PCDは、プロトカテチュ酸34の酸化を触媒することにより結合/切断バッファーから酸素を除去する。 PCD溶液を1mLのアリコートに分割します。ストック濃度は~1 μM. 液体窒素中のアリコートをスナップフリーズし、長期保存のために-80°C、または-20°Cで長期保存します。 新しいバインディング バッファーを準備します (表 1)。smFRET切断実験のために2 mMMgCl 2で2 mM CaCl2を置き換えます。 イメージングバッファの1 mLを準備する(表1)。酸素清掃システムの活性を維持するために、フローセルに導入されるまで、イメージングバッファを氷上に保持します。 4. 蛍光標識HJの調製 トリス-EDTAバッファー(表1)の凍結乾燥オリゴ(表2)を100μMの濃度に再構成する。 表1に記載されているX0オリゴの各々の等化部分〜3μLを混合して合成接合部を調製する。 95°Cで5分間加熱し、その後1°C/分の速度でRTに遅い冷却を行い、熱ブロックまたはPCRサーモサイクラーを使用して、所望の冷却速度を達成します。 10%トリスボレート-EDTAポリアクリルアミドゲルの8 cm x 8 cmに混合物をロードします。100Vを適用し、〜2時間ゲルを実行します。バンドは目ではっきりと見え、その色は紫色です。 きれいな刃とアニール基板のバンドを物品格上。ゲル片をオートクレーブされた1.5 mLチューブに移します。 きれいなプランジャーでチューブ内のゲル片を粉砕し、TE100バッファーの100 μLを追加します(表1)。 サーモミキサーで1,500rpmでチューブを20°Cで振り、HJを抽出するか、4°Cで一晩インキュベートします。 基板35を含む溶液にエタノール沈殿を行う。 TE100 バッファーの 20 μL で基板を再中断します (表 1)。最終的な濃度は、各チューブで1-3 μM. アリコット2 μLであり、-20 °Cで保存します。 5. GEN1のタンパク質発現と精製 切り捨てられたヒトGEN11、2、3、4、5の発現のためのプラスミドを、エントリベクターのPCRによりC終端20でヘキサヒスチジンタグで構築する。注: N 端末のタグ付けにより、GEN1 が非アクティブになります。非構造化Cテールは、全長GEN1の精製を大幅に困難にします。また、全長GEN1は、切り捨てられたバージョン23よりも少ない活性を示す報告された。 発現ベクトルを大腸菌BL21-コドンプラス(DE3)-RIPL株に変換します。 変換した細胞を2つの6Lフラスコに接種し、0.8のOD600に達するまで180rpmで振盪を起こす37°Cで2Lのルリアブロス培中を含む。 培養物を16°Cに冷却し、0.1mMイソプロピルβ-d-チオガラクピラノシド(IPTG)でGEN1発現を48時間誘導する。 遠心分離機で1000 x gで4°Cで回して細胞を収穫します。培養の各リットルは、ペレットの5-6グラムを得る。 上清を廃棄し、4 mL/gの細胞を用いて、リシスバッファー(表1)でペレット化した細胞を再懸濁する。 30 kPsiで細胞破壊器を使用して細胞分解を行い、4°Cで1時間10,000 x gでスピンダウンします。上清を回収し、0.45 μmフィルターを使用して氷の上に濾過します。 バッファーA(表1)を用いて5mL Ni-NTAカラムを2.5ml/分の流量で濾液を通過させることにより、FPLCを用いてタンパク質精製を行う。 15カラムボリューム(CV)で洗浄します。バッファAと500mMイミダゾールの線形勾配を5mL画分で20CV以上のElute。GEN1は、約100mMイミダゾールでカラムから溶出する。 収集された分画からピペット10 μLアリコートは、各アリコートに2x SDS負荷染料の等しい体積を追加します。90°Cで5分間加熱し、冷却し、サンプルをスピンダウンしてサンプルを変性させます。 サンプルを10%のビストリスゲルにロードします。クーマッシーブリリアントブルーを使用して200 V.ステインで30~45分間ゲルを実行し、その後デステインします。精製されたGEN1を含む分数を収集します。 緩衝C(表1)を用いて希釈することにより、結合分画の塩濃度を100mMに減らす。 低塩タンパク質をバッファーB(表1)を用いて3mL/minの流量で5mLヘパリンカラムを通す。 バッファBと1 M NaClで20 CVのグラデーションを使用して10 CV.Eluteで洗浄します。GEN1が約360 mM NaClを溶出する5mL分画を収集します。 手順 5.8 で説明されているように、精製された GEN1 分画の eluted 分数を確認します。これらの分数を組み合わせ、バッファ C を使用して 100 mM NaCl に希釈します。 バッファーBを使用して、低塩タンパク質を1mL/min流量で陽イオン交換カラムにロードします。 バッファBと1 M NaClを使用して40 CVのグラデーションで溶出します。GEN1が約300mM NaClを溶出する1.7mL分画を収集します。 ステップ 5.8 で説明されているように、ELuted 画分の GEN1 の純度を確認します。 最も純粋な分画を組み合わせ、ストレージバッファに対して4°Cで透析を行います(表1)。透析中にバッファーの少なくとも1つの交換を実行します。 タンパク質濃度~0.5–1 mg/mLを測定します。小管中の10~15μLのダイアライズタンパク質をアリコートし、液体窒素中のフラッシュフリーズを行い、-80°Cで保存します。 6. 単分子FRET実験 注: smFRET 実験は、前述の31に基づくカスタム構築された目的ベースの TIRF セットアップ (図 1C)に基づいて実行されます。 単色FRET実験 100x TIRFの目的に浸漬オイルの1滴を適用します。EMCCDを適切なゲインに設定して、信号をバックグラウンドに最適化し、飽和を防ぎます。注:レーザーを直接見ないで、レーザーを合わせるときに保護ゴーグルを着用しないでください。 フローセルをサンプルホルダーに慎重に置きます。オイルがカバースリップに触れるまで、粗い調整を使用して徐々に目的を上げます。 緑色のレーザー(532 nm)をオンにします。目的の微調整モードに切り替えます。カメラポートに放出を指示し、モニター上の画像を観察します。 カバースリップの機能化された表面がフォーカスに持ち込まれ、モニターで観察されるまで、目的の高さを調整します。注:EMCCDによる画像取得により、アコスト光学調合フィルタ(AOTF)を介してレーザー励起がトリガされ、画像が取得されていないときにサンプル光漂白を防止します。 カバースリップの機能化された表面からの背景が蛍光標識HJに流れる前に少数のスポットを超えないことを確認してください。 TE100バッファー(表1)で約1000回ストック基板を1~5nMの最終濃度に希釈します。希釈基板のピペット 0.2~0.5 μL をOSSを用いるイメージングバッファの120 μLを0.5mLチューブに入れます。 フローセルの出口をシリンジポンプに接続します。フローセルの入り込み管を1.5mLチューブに挿入し、シリンジポンプを30~50μL/minの流量で操作し、チューブから溶液を引き出します。 緑色のレーザーで簡単に画像化することにより、表面の良好なカバレッジ(均質に分布し、十分に間隔をあけた基板の100~300)を頻繁に確認してください。 表面カバレッジがまだ十分でない場合は、溶液から蛍光標識されたHJが表面に沈降するか、流れるステップを繰り返すのに数分間待ちます。 30~50 μL/minで別の120 μLのイメージングバッファー(表1)を流し、無結合に標識されたHJを洗浄します。その後、OSSが溶存酸素を枯渇させるのを可能にするために、フローセルを5分間座らせます。蛍光素の光漂白は、イメージングの開始時に最小限にする必要があります。 露光時間(~60ミリ秒)を設定し、データ転送速度(~104ミリ秒)に基づいてソフトウェアによってサイクル時間が自動的に設定され、必要なサイクル数またはフレーム数(~400)を指定します。ドナー(Cy3)および受入者(Alexa Fluor 647)からの放出は、画像スプリッタデバイスによって2つのカラーチャンネルに分割される。 サーフェス上の適切な領域を見つけ、目的と記録の高さを調整して画像に焦点を合わせ、ムービーを 16 ビット TIFF 形式で保存します。 新しい領域に移動します。注: 同じ領域を 2 回イメージングしないように、常に一方向にのみ移動します(出口から入口まで)。 120 μL のイメージング バッファーに 1、2、5、10、25、50、75、および 100 nM GEN1 を一度に 1 つずつ準備します。30~50 μL/minの流量で溶液を流します。注:GEN1によるHJの結合またはフリーHJの異性化のように、必要な測定が定常状態で行われる場合は、流れが止まってから3~5分待って映画を録画します。GEN1濃度ごとに新しい領域から3~4本の映画を獲得。 GEN1によるHJの切断のように連続的な流れの下で測定が行われる場合は、GEN1の流入口の前に5~10sの記録を開始する。6チャンネルフローセルの新しいチャンネルに移動して測定を繰り返します。 最後に、固定蛍光ビーズスライドを使用して、画像分割装置内のドナーと受諾粒子を互いにマッピングする。 1 μm 径蛍光ビーズの 0.2 μL を 1 M トリスの 500 μL (pH = 8.0) に加えて、ビーズが表面に付き付けられるようにします。 両面粘着シールの 22 mm x 22 mm の部分の中に正方形 (18 mm x 18 mm) を切ります。76 mm x 25 mm クォーツ スライドの中央にピースをはがし、貼り付けします。 希釈ビーズ溶液の50 μLを置き、5-10分間放置して落ち着きます。正方形の部分の上に22 mm x 22 mmカバースリップを取り付けます。組織で余分なビーズ溶液を乾燥させ、次いでエポキシ接着剤によってチャンバーを密封する。 60ミリ秒の露出時間でビーズスライドの100フレームを取得します。注意: 検出器の飽和を避けるために、レーザーパワーとEMCCDゲインを最小限に抑えます。 ソフトウェアパッケージ(例えば、TwoTones)をインストールし、ユーザーマニュアル36に示されているように、その中のムービーを開きます。ドナーおよびインセプターチャネル内の個々のビーズの位置を選択します。マニュアルで説明されているように、変換行列を生成します。注:このソフトウェアは、ドナーとインセプターチャネル内の粒子の位置を一致させ、画像分割デバイスのわずかなミスアライメントを修正するために変換マトリックスを使用しています。 [ファイル]に移動し、[ムービーの読み込み]を押し、ムービー ファイルを選択して[開く]を押します。ファイルメニューで、TFORMを押して、ビーズスライドから生成された変換マトリックスを選択します。偽陽性が含まれなくなるまで、ドナーチャネルと受諾チャネルのしきい値を調整します。 [チャンネル フィルタ]メニューで、[D&A] オプションを選択して、ドナーとアパニタの両方でラベル付けされたパーティクルを選択します。 最も近い近傍の制限フィールドをチェックして、互いに非常に近い分子を除外します。非常に偏心分子を除外し、非常に広いまたは非常に狭い分子を除外するために幅の制限をチェックするには、最大楕円性をチェックしてください。 ヒストグラムを構築するためにツートーンマニュアルで指示されているようにプロットヒストCWを入力します。注:「明らかな」FRET効率は、受け入れ者の放出をドナーおよび受入者からの総排出量で割ることによってプログラムによって計算される。ツートーンは、FRET効率に対する分子の状態の分布をビン化するために100の間隔を使用します。 各分子のタイムトレースを生成するために、Twotonesマニュアルで指示されているようにプロットTimetraceCWを入力します。注: 時間トレースは vbFRET37でさらに分析して、異なる FRET 状態、それぞれの所因時間、および異なる状態間の遷移率を識別できます。 2色交流励起FRET(ALEX)実験 ドナーと受容者の連続したフレームから成るムービーを、緑と赤のレーザーで直接励起し、それぞれ約80ミリ秒の持続時間で記録します。 取得した ALEX ムービーをツートーンで開きます。ドナー励起(DexDem)によるドナー放出:3つのチャネルに対して、適切な検出閾値を~300として設定します。ドナー励起による受容者放出(DexAem);直接励起(AexAem)による受容者の放出。 チャネルフィルタDexDem&DexAem&AexAemを適用して、ドナーとアセプターの両方を持つパーティクルを選択します。パーティクルを 3 つのチャネルで ~200 ~300 にリンクします。 プロットヒスタレックス MATLAB コードを使用して、ALEX ヒストグラムを生成します。ヒストグラムの異なるピークをガウス関数に合わせ、Originソフトウェア38を使用して曲線の下の領域の各母集団の割合を決定します。注:結合アッセイのピークは結合されたGEN1-HJ複合体に対応し、自由HJではピークは相互作用する異性体を表す。 plotTimetraceALEX MATLABコードを使用して、直接励起によるドナー放出、およびFRETおよび直接励起による受容放出を示す各分子のタイムトレースを生成します。注:ALEXタイムトレースは、ドナーとアセプターの両方の放出を示すために独立してトレースしますが、単色FRETよりも低い時間分解能で。単色 FRET と同様に、ALEX タイム トレースを vbFRET でさらに分析して、異なる FRET 状態とそれぞれの所持ち時間を識別できます。 結合母集団とGEN1濃度のパーセンテージを双曲線関数に合わせて解離定数を決定します。 タイムラプスシングルカラーFRET 観測されたダイナミクスの速度に応じて、緑色のレーザーの露出時間を 60 ミリ秒、サイクル時間を 624 ミリ秒以下に設定します。 6チャンネルフローセルの1チャンネルで流量を110μL/minに設定します。フローセル内のGEN1の入り口の前に、少し録音を開始します。注:連続的な流れは、蛍光素の急速な光漂白につながるので、イメージングとタンパク質のエントリの開始を同期させることで、キャプチャされたイベントの数を最大化します。最適なシリンジポンプの読み取りは、デッドボリュームとフローセルを組み立てるために使用される正確なチューブに依存します。私たちの場合は~25 μLです。 合計取得時間 78 秒で約 125 フレームのムービーを取得します。記録の最後に、サンプルを赤いレーザーにそれぞれ50フレーム、25ミリ秒の露出時間で赤いレーザーにさらして、受け入れをプローブします。注: この方法は、励起サイクルの数を減らすことによって切断実験の観察ウィンドウを延長します。偏光のkオンおよびkオフとしての運動パラメータは、分布をバイ指数モデル30、38に適合させることによって導出される。 7. 電気泳動シフトアッセイ(EMSA) 50 μLの総体積において、EMSA結合バッファーで30分間RTで50 pM Cy5標識HJを用いてGEN1の所望の濃度をインキュベートする(表1)。 6%トリスボレートEDTAゲルの8 cm x 8 cmのサンプルをロードします。RTで1x TBEバッファで1時間+20分の100Vを使用してゲルを実行します。 各レーンの総蛍光強度に対する相対的な寄与からGEN1濃度での結合基板のパーセンテージを決定する。注:GEN1モノマー-HJ(バンドI)は、その大きさの合意によって同定され、その大きさは、ニックされたHJ21、30に対するGEN1モノマーのピコモル結合と同定される。GEN1-dimer-HJは、Gen1モノマーをHJ21,23に段階的に結合するため、バンドIIに割り当てられます。 方程式を使用して、見かけの結合定数Kd-モノマー アプリ EMSAとKd-ダイマー アプリ-EMSAを計算します。どこ:最大は、それぞれの種がその最大結合に達した濃度(モノマーまたはダイマー);。n はヒル係数です。Kd-app-EMSAは、各種の明らかな結合定数であり、モノマーまたはダイマーの半分の最大値が存在するGEN1の濃度を示す。