Hier wird ein Protokoll zur Durchführung der einmolekularen Förster-Resonanzenergieübertragung zur Untersuchung der HJ-Auflösung vorgestellt. Zur Bestimmung der Dissoziationskonstanten wird eine zweifarbige Wechselanregung verwendet. Einfarbigezeitraffe smFRET wird dann in Echtzeit-Spaltungstests angewendet, um die Verweilzeitverteilung vor hj-Auflösung zu erhalten.
Massenmethoden messen das Ensembleverhalten von Molekülen, bei denen die individuellen Reaktionsraten der zugrunde liegenden Schritte in der gesamten Bevölkerung gemittelt werden. Die einmolekulare Förster-Resonanzenergieübertragung (smFRET) ermöglicht die Aufzeichnung der konformen Veränderungen, die von einzelnen Molekülen in Echtzeit stattfinden. Daher ist smFRET bei der Messung struktureller Veränderungen im Enzym oder Substrat während der Bindung und Katalyse leistungsfähig. Diese Arbeit stellt ein Protokoll zur Einzelmolekül-Bildgebung der Wechselwirkung einer Vier-Wege-Holliday-Kreuzung (HJ) und Spaltendonuklease I (GEN1), eines zytosolischen homologen Rekombinationsenzyms, vor. Ebenfalls vorgestellt werden einfarbige und zweifarbige abwechselnde Anregung (ALEX) smFRET Experimentelle Protokolle, um die Auflösung des HJ durch GEN1 in Echtzeit zu folgen. Die Kinetik der GEN1-Dimerisierung wird am HJ bestimmt, das eine Schlüsselrolle bei der Auflösung des HJ spielen soll und bis heute schwer fassbar ist. Die hier beschriebenen Techniken können weit verbreitet sein, um wertvolle mechanistische Erkenntnisse vieler Enzym-DNA-Systeme zu erhalten.
Einzelmolekül-Methoden auf Basis der Fluoreszenzdetektion bieten hohe Signal-Rausch-Verhältnisse1. FRET ist eine spektroskopische Technik, die Entfernungen im Bereich von 1–10 nm messen kann, wodurch diese Technik als molekulares Lineal zur Messung von Entfernungen im Nanometerbereich2,3dargestellt wird. Das Absorptionsspektrum des Akzeptors hat eine partielle spektrale Überlappung mit dem Emissionsspektrum des Spenders am kürzeren Wellenlängenende. FRET wird durch den strahlungsfreien Energietransfer zwischen Spender und Akzeptorpaar vermittelt, während die Effizienz der Energieübertragung von der Entfernung und Ausrichtung des Akzeptorsabhängt 4.
Mehrere Ansätze wurden implementiert, um den Hintergrund zu minimieren und die Detektionseffizienz des Fluoreszenzsignals5,6zu verbessern. Ein Ansatz ist die konfokale Mikroskopie, bei der ein Loch den Anregungspunkt auf eine Größe unterhalb der Beugungsgrenze7beschränkt. Ein weiterer Ansatz ist die totale interne Reflexionsfluoreszenz (TIRF), eine Weitfeldbeleuchtungstechnik, bei der das Licht außerhalb der Achse über einen kritischen Winkel8gerichtet wird. Das Licht wird dann an der Schnittstelle zwischen Glas und wässriger Lösung vollständig nach innen reflektiert, wodurch eine evaneszente Welle entsteht, die nur die an der Glasoberfläche befestigten Fluorophore beleuchtet und den Hintergrund der Fluorophore im Rest der die Lösung.
In der konfokalen Mikroskopie können die Moleküle entweder frei diffundiert oder oberflächenimmobilisiert werden. Die erreichte zeitliche Auflösung kann innerhalb von Mikrosekunden bis zu mehreren Millisekunden9liegen. Der konfokale Nachweis für ein einzelnes Molekül erfolgt durch Einphotonenlawinendiode (SPAD) und Punkt-für-Punkt-Scannen des Interessenbereichs10. In TIRF wird eine Zeitreihe von einigen hundert Molekülen, die auf der Oberfläche immobilisiert sind, von einem positionsempfindlichen zweidimensionalen Ladungs-gekoppelten Detektor (CCD) aufgezeichnet. Das CCD verstärkt das Fluoreszenzsignal entweder durch verstärkte Phosphorsieb und Mikrokanalplatte oder on-chip-Multiplikation von Photoelektronen (EMCCD). Die zeitliche Auflösung ist abhängig von der Auslesegeschwindigkeit und Quanteneffizienz des CCD und in der Regel in der Größenordnung von wenigen Dutzend Millisekunden6.
HJ ist ein zentrales Zwischenprodukt in der DNA-Reparatur und -Rekombination11,12,13,14. HJ hat zwei durchgehende und zwei kreuzende Stränge, die sich zwischen den durchgehenden Strängen verbinden, ohne sich gegenseitig zu überschneiden. HJ existiert in Lösung als X-gestapelte Konformere, die durch die kontinuierlichen Stränge, die sich kreuzen und die Kreuzungsstränge in den anderen Konformerenkontinuierlich werden, kontinuierlichwerden 15 . Die Isomerpräferenz des HJ ist abhängig von der Kernsequenz und der ionischen Umgebung und wurde von FRET16,17,18,19ausgiebig untersucht.
GEN120 ist ein monomeres Protein in Lösung21 und erfordert eine Dimerisierung, um die HJ zu spalten, wodurch eine ordnungsgemäße Trennung der rekombinierten Stränge22,23ermöglicht wird. Die Stapelkonformerpräferenz des HJ beeinflusst das Ergebnis der genetischen Rekombination, indem die Ausrichtung der Auflösung durch die HJ-Resolvasen24gesetzt wird. Verstehen, wie GEN1 die HJ bindet, koordiniert die beiden Einschnitte und stellt sicher, dass seine volle Auflösung alle unter intensiver Studie21,22,23,25,26 wurden ,27,28,29,30.
In dieser Studie wird eine objektive TIRF-Einrichtung verwendet, wie zuvorbeschrieben 31. Zweifarbige Wechselanregung (ALEX) wird angewendet, um die konformen Veränderungen bei der Wechselwirkung von GEN1 mit Fluorophor mit der Bezeichnung HJ zu bestimmen. ALEX produziert 2D-Histogramme auf der Grundlage von zwei ratiometrischen Parametern FRET-Effizienz E, die spender-akzeptierweise distanzabhängig ist, und dem Stoichiometrieparameter S, der den Spender-Akzeptor-Stoichiometrie32misst. ALEX ermöglicht die Sortierung fluoreszierender Arten auf der Grundlage der Stoichiometrien der Fluorophore, einschließlich nur für Spender, nur für Akzeptoren und gemischte Subpopulationen. ALEX kann den Einsatz von FRET auf den gesamten Bereich ausdehnen und Unterschiede in der Fluorophorhelligkeit und Oligomerisierung erkennen sowie Makromolekül-Liganden-Wechselwirkungen überwachen33.
Es wird festgestellt, dass es GEN1 konsequent gelingt, die HJ innerhalb der Lebensdauer des GEN1-HJ-Komplexes zu lösen. Die zeitabhängigen Konformationsänderungen werden aus den Zeitspuren einzelner Moleküle abgeleitet, während die Histogramme die Verteilung der zugrunde liegenden Populationen darstellen. Mit dem zeitraffigen einfarbigen FRET werden schnelle Einschaltraten und langsame Off-Raten für den GEN1-Dimer demonstriert, die die Affinität des montierten GEN1-Dimers beim ersten Schnittprodukt erhöhen.
In dieser Studie wurden verschiedene smFRET-Techniken implementiert, um die Kinetik der HJ-Auflösung durch GEN130zu bestimmen. Ähnliche smFRET-Ansätze wurden verwendet, um die Doppelklappen-DNA-Konformationsanforderung und Spaltung durch die DNA-Replikation und Reparaturklappe Endonuklease 142,43,44zu folgen. Hier werden wichtige Schritte in diesem Protokoll erläutert. Die Silanisierungsreaktion sollte frei von Feuchtigkeitseinspuren sein. Die Pegylierungslösung sollte schnell auf das silanisierte Glas aufgetragen werden, sobald PEG gelöst ist, um eine Hydrolyse zu vermeiden. In der Mehrkanal-Durchflusszelle sollte jede eingeschlossene Luft in der Klebefolie entfernt werden, um Leckagen zwischen benachbarten Kanälen zu vermeiden. Die PCA-Lösung sollte frisch zubereitet werden, da sie im Laufe der Zeit oxidiert. Die Zugabe von 10 N NaOH sollte tropfenweise sein, mit Wirbel zwischendurch. Der Fluoreszenzhintergrund im Deckblatt sollte minimal sein, bevor der fluoreszierend beschriftete HJ geflossen ist. Die Bildgebung in der Durchflusszelle sollte in eine Richtung durchgeführt werden, um bildgebende gebleichte Bereiche zu vermeiden. In ALEX-Experimenten sollte die Leistung des roten Lasers reduziert werden, um ein schnelles Bleichen des Akzeptors zu vermeiden. In den Zeitrafferexperimenten muss die Zykluszeit kürzer sein als das schnellste Ereignis.
smFRET ist eine empfindliche Technik, die wertvolle Echtzeit-Einblicke in biomolekulare Reaktionen liefern kann. Diese Methode hat jedoch mehrere technische Herausforderungen, darunter die Erzielung einer messbaren Veränderung des FRET während der biochemischen Reaktion. Dies ist notwendig, um gut getrennte Merkmale in den Histogrammen und unterscheidbare Zustände in den Zeitspuren zu erhalten. In vielen Fällen erfordert smFRET eine sorgfältige Auslegung der Substrate, die Auswahl der Fluorophorpaare und ihrer Positionen sowie die Verstärkung von FRET-Änderungen im DNA-Substrat aufgrund der geringen strukturellen Veränderungen im Substrat45. Ein weiterer Ansatz für die Durchführung von FRET ist die Verwendung von markierten Proteinen46. Das Beobachtungsfenster in FRET wird durch die Stabilität des Akzeptors wie Cy5 oder Alexa Fluor 647 begrenzt, die tendenziell schneller bleicht als der Spender (in diesem Fall Cy3). Daher erfordert FRET eine kontinuierliche Suche nach stabilen Fluorophoren, um die Versuchsdauer zu verlängern und Anstrengungen zur Entwicklung von Sauerstoff-Aufräumsystemen zu unternehmen, um das Fluoreszenzsignal zu verlängern und das Signal-Rausch-Verhältnis zu maximieren47,48 .
Zu den Tipps für die Fehlerbehebung in smFRET gehört das Ausbalancieren der verschiedenen Parameter, die an der Bildgebung beteiligt sind, wie z. B. Laserleistung, Belichtungszeit, Zykluszeit und Anzahl der Zyklen, um die Fluoreszenzemission zu maximieren, die Versuchsdauer zu verlängern und geeignete Abtastintervalle für die Enzymdynamik. Längere Beobachtungszeiten und minimale Effekte durch Photobleichungen sind unerlässlich, um eine hohe Treue zu erhalten, um Zeitverteilungen zu erhalten, die die Enzymdynamik darstellen. ALEX erzeugt bessere Histogramme, da diese Methode niedrigeren Beiträgen von photobleached Partikeln im Vergleich zu einfarbigen FRET ausgesetzt ist. Die zeitliche Auflösung in ALEX ist jedoch niedriger als die im einfarbigen FRET.
Schließlich überbrückt smFRETs Schwerpunkt auf dem Nachweis von konformen/strukturellen Veränderungen einzelner Moleküle in Echtzeit die Lücke zwischen hochauflösenden Strukturtechniken (z. B. Röntgenkristallographie, Kernspinresonanz, Elektronenmikroskopie), die atomare Auflösung strukturelle Details unter statischen Bedingungen und Bulk-Methoden, die das Ensemble Durchschnitt einer messbaren Eigenschaft ergeben. In vielerlei Hinsicht hat sich smFRET als eine leistungsfähige Technik zur Erforschung biologischer Systeme in Echtzeit erwiesen.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von der King Abdullah University of Science and Technology durch Kernfinanzierung und Competitive Research Award (CRG3) an S. M. H. unterstützt.
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) | Sigma-Aldrich | 238813 | |
0.1 M sodium bicarbonate buffer | Fisher | 144-55-8 | |
10 % Novex Tris-Borate-EDTA gel | Thermo Fisher Scientific | EC6275BOX | |
100 X TIRF objective | Olympus | NAPO 1.49 | |
3,4-dihroxybenzoic acid (PCA) | Sigma-Aldrich | P5630 | |
3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | 741442 | |
6% Novex Tris-Borate-EDTA gel | Thermo Fisher Scientific | EC6265BOX | |
Adhesive sheet | Grace bio-labs | SA-S-1L | |
Benchtop refrigerated centrifuge | Eppendorf | Z605212 | |
Biotin-PEG | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA 5000 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | New England Biolabs | B9001S | |
Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | 31307 | |
cation exchange column | GE healthcare | MonoS (4.6/100) | |
Cell distruptor | Constant Cell Disruption System | TS5/40/CE/GA | |
Coomassie Brilliant Blue | MP Biomedicals | 808274 | |
Cy3 emission filter | Chroma | HQ600/40M-25 | |
Cy5/Alexa Fluor 647 emission filter | Chroma | HQ700/40M-25 | |
Dichroic for DV2 filter cube | Photometrics | 630dcxr-18×26 | |
Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | R0861 | |
Drill | Dremel | 200-1/21 | |
Electronic cutter | Copam | CP-2500 | |
EMCCD camera | Hamamatsu | C9100-13 | |
Epoxy glue | Devcon | 14250 | |
FPLC Aktapurifier UPC 10 | GE Healthcare | 28406268 | |
GelQuant.NET software | biochemlabsolutions.com | Version 1.8.2 | |
GEN1 entry vector | Harvard plasmid repository | HSCD00399935 | |
Glycerol | Sigma Life Science | G5516 | |
green laser (emission 532 nm) | Coherent | Compass 315M-100 | |
Heparin column | GE healthcare | HiTrap Heparin column | |
HEPES | BDH | BDH4162 | |
Image splitter | Photometrics | Dualview (DV2) | |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
Inverted microscope | Olympus | IX81 | |
Isopropyl-ß-D-thiogalactoside (IPTG) | Goldbio. | 12481C100 | |
Laser scanner | GE healthcare | Typhoon Trio | |
LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
Long pass 532nm filter | Semrock | LPD02-532RU-25 | |
Magnesium Chloride | Sigma Life Science | M8266 | |
mPEG | Laysan Bio | mPEG-SVA 5000 | |
Neutravidin | Pierce | 31000 | |
Ni-NTA column | GE healthcare | HisTrap FF | |
NuPAGE 10% Bis-Tris gels | Novex Life technologies | NP0301BOX | |
NuPAGE 10% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NP0302PK2 | |
Origin software | OriginLab Corporation | Version 8.5 | |
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Alexis Biochemicals | 270-184-G025 | |
Phosphate-buffered saline | GIBCO | 14190 | |
Polyethylene Tubing (I.D. 0.76 mm O.D. 1.22mm) | Fisher (Becton Dickinson) | 427416 | |
Protocatechuate 3,4-dioxygenase (3,4-PCD) | Sigma-Aldrich | P8279-25UN | |
Quad-band dichroic | Chroma Inc | Z405/488/532/640rpc | |
red laser (emission 640 nm) | Coherent | Cube 640 100C | |
Sodium Chloride | Fisher Chemical | S271 | |
Sorvall RC-6 plus centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46910 | |
Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000 | |
Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3007 | |
Teflon tweezers | Rubis | K35A | |
Tris Base | Promega | H5135 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-90K | |
Ultrafiltration membrane | Millipore | UFC90300 |