Identificazione delle impronte di RNA:Complessi proteici tramite l'immunoprecipitazioni dell'RNA in Tandem seguita dal sequenziamento (RIPiT-Seq)

All’interno delle cellule, l’RNA esiste in complesso con proteine per formare complessi di RNA:proteina (RRP). Gli RPP sono assemblati intorno alle proteine leganti l’RNA (RBP, quelle che legano direttamente l’RNA) ma comprendono anche non-RP (quelli che legano gli RBP ma non l’RNA) e sono spesso di natura dinamica. Gli RBP e i loro cofattori funzionano collettivamente all’interno dei RSP per eseguire funzioni normative. Ad esempio, nel percorso di decadimento dell’mRNA mediato senza senso (NMD), le proteine UPF (UPF1, UPF2 e UPF3b) riconoscono il ribosoma terminato prematuramente. Ognuna delle proteine UPF può legarsi all’RNA, ma è solo quando si assemblano insieme che inizia a formarsi un complesso nmD attivo. All’interno di questo complesso, UPF1 è ulteriormente attivato dalla fosforilazione da un SMG1 non-RBP, e tale attivazione UPF1 alla fine porta al reclutamento di fattori di induzione del decadimento mRNA^1,2. In questo esempio, gli RBP richiedono cofattori non RBP per il reclutamento e l’attivazione del complesso RNP che attiva NMD. Un’altra proprietà degli RNP è la loro eterogeneità compositiva. Si consideri il spicchio, che esiste in distinti complessi E, A, B o C. Diversi complessi spliceo hanno proteine sovrapposte e distinte³. Per studiare le funzioni di RNP, è importante chiarire quali RNA sono legati da un RBP e le sue proteine associate. Esistono molti metodi per raggiungere questo obiettivo, con ogni approccio che ha i suoi vantaggi e svantaggi distinti^4,5,6,7.

I metodi molto popolari per identificare i siti di legame RBP – crosslinking seguito da immunoprecipitazioni (CLIP) e le sue varie variazioni – si basano sulla luce ultravioletta (UV) per collegare un RBP all’RNA⁸. Tuttavia, questo non è un approccio efficace per i non-RBP all’interno dei RSP, che non contattano direttamente l’RNA. Qui, descriviamo un approccio alternativo applicabile sia agli RBP che ai non-RBP, per isolare e identificare i loro siti di legame dell’RNA. Questo approccio chiamato immunoprecipitazioni dell’RNA in tandem (RIPiT) è costituito da due fasi di immunoprecipitazioni, che aiutano a raggiungere una maggiore specificità rispetto a una singola purificazione (Figura 1)^9,10. Poiché le singole fasi di immunoprecipitazioni (IP) possono essere eseguite a una cordenza inferiore rispetto al CLIP, RIPiT non dipende dalla disponibilità di anticorpi in grado di resistere alla presenza di forti detergenti durante l’immunoprecipitazioni. Il vantaggio più unico di RIPiT è la capacità di indirizzare due diverse proteine in due fasi di purificazione; questo fornisce un modo potente per arricchire un complesso RNP compositivamente distinto da altri complessi simili¹¹.

Piccole variazioni alla procedura RIPiT possono migliorare ulteriormente l’arricchimento del RNP. Ad esempio, alcune interazioni RNA-proteina o proteina-proteina all’interno dei RNP sono transitorie e può essere difficile purificare in modo efficiente le impronte di tali complessi. Per stabilizzare tali interazioni, i RNP possono essere incrociati all’interno delle cellule con formaldeide prima della lisi cellulare e RIPiT. Ad esempio, abbiamo osservato che una debole interazione tra il fattore centrale del complesso di giunzione dell’esonio (EJC), EIF4AIII e il fattore di smontaggio dell’EJC, IL PYM¹² può essere stabilizzato con il trattamento della formaldeide in modo che vengano arricchite più impronte di RNA (dati non (visualizzato). Prima della raccolta cellulare e RIPiT, le cellule possono anche essere trattate con farmaci per stabilizzare o arricchire i RNP in un determinato stato. Ad esempio, quando si studiano proteine che vengono rimosse dall’mRNA durante la traduzione (ad esempio, l’EJC¹³, UPF1¹⁴), il trattamento con inibitori di traduzione come la damacina, il cicloseximide o l’armonica può portare ad un aumento dell’occupazione di proteine sugli RNA.

La quantità di RNA recuperata da RIPiT è solitamente bassa (0,5-10 pmoles, cioè 10-250 ng RNA considerando una lunghezza media dell’RNA di 75 nt). La ragione principale di questo è che solo una piccola frazione di una data proteina è presente in complesso con altre proteine all’interno di RRP (qualsiasi proteina “libera” IP’ed nel primo passo viene persa durante il secondo IP). Per generare librerie RNA-Seq da questo RNA, abbiamo anche delineato qui un adattamento del protocollo pubblicato in precedenza adatto a tali input di RNA bassi^15,16 (Figura 2), che produce campioni pronti per la sequenziamento ad alta velocità in 3 Giorni.