Identificação de pegadas de RNA: complexos proteicos via imunoprecipitação de RNA em tandem seguido de sequenciamento (RIPiT-Seq)

Dentro das células, o RNA existe no complexo com proteínas para formar os complexos RNA: protein (RNPs). RNPs são montados em torno das proteínas de ligação do RNA (RBPs, aqueles que ligam diretamente o RNA) mas igualmente compreendem de non-RBPs (aqueles que ligam RBPs mas não o RNA), e são frequentemente dinâmicos na natureza. Rbps e seus cofatores funcionam coletivamente dentro de rnps para executar funções regulatórias. Por exemplo, na via de deterioração de mRNA mediada por disparates (NMD), as proteínas UPF (UPF1, UPF2 e UPF3b) reconhecem o Ribossome prematuramente finalizado. Cada uma das proteínas de UPF pode ligar ao RNA, mas é somente quando montam junto que um complexo ativo de NMD começa a se formar. Dentro deste complexo, UPF1 é ativado mais pela fosforilação por um SMG1 não-RBP, e essa ativação UPF1 eventualmente leva ao recrutamento de fatores Indutores de decaimento de mRNA^1,2. Neste exemplo, o RBPs requer cofatores não RBP para recrutamento e ativação do complexo RNP que aciona a NMD. No entanto, outra propriedade de RNPs é a sua heterogeneidade composicional. Considere o spliceosome, que existe em distintos complexos de E, A, B ou C. Os complexos spliceossoma diferentes têm as proteínas de sobreposição e distintas³. Para estudar as funções da RNP, é importante elucidar quais RNAs são vinculados por uma RBP e suas proteínas associadas. Existem muitos métodos para fazer isso, com cada abordagem tendo suas distintas vantagens e desvantagens^4,5,6,7.

Os métodos amplamente populares para identificar sítios de ligação da RBP — reticulação seguida de imunoprecipitação (CLIP) e suas várias variações-dependem da luz ultravioleta (UV) para vincular uma RBP ao RNA⁸. Entretanto, esta não é uma aproximação eficaz para non-RBPs dentro de RNPs, que não contatam o RNA diretamente. Aqui, nós descrevemos uma aproximação alternativa que seja aplicável aos RBPs e não-RBPs igualmente, para isolar e identificar seus locais da ligação do RNA. Essa abordagem denominada imunoprecipitação de RNA em tandem (ripit) consiste em duas etapas de imunoprecipitação, que auxiliam na obtenção de maior especificidade em relação a uma única purificação (Figura 1)^9,10. Como as etapas individuais da imunoprecipitação (IP) podem ser executadas em uma mais baixa rigor em comparação ao grampo, o ripit não depende da disponibilidade dos anticorpos que podem suportar a presença de detergentes fortes durante a imunoprecipitação. A vantagem a mais original de RIPiT é a habilidade de alvejar duas proteínas diferentes em duas etapas da purificação; Isto fornece uma maneira poderosa de enriquecer um complexo composicionalmente distinto de RNP de outros complexos similares¹¹.

Pequenas variações no procedimento do RIPiT podem aumentar ainda mais o enriquecimento de RNP. Por exemplo, algumas interações RNA-proteína ou proteína-proteína dentro de RNPs são transitórios e pode ser difícil purificar eficientemente pegadas de tais complexos. Para estabilizar essas interações, os RNPs podem ser reticulados dentro de células com formaldeído antes da lise celular e do RIPiT. Por exemplo, nós observamos que uma interação fraca entre o fator de núcleo complexo da junção do exon (EJC), EIF4AIII e o fator da desmontagem de EJC, PYM¹² pode ser estabilizado com o tratamento do formaldehyde tal que mais pegadas do RNA são enriquecidas (dados não mostrado). Antes da colheita da pilha e do RIPiT, as pilhas podem igualmente ser tratadas com as drogas para estabilizar ou enriquecer RNPs em um estado particular. Por exemplo, ao estudar proteínas que são removidas do mRNA durante a tradução (por exemplo, a EJC UPF1¹⁴), o tratamento com inibidores de tradução como a puromicina, cicloheximida ou harringtonina pode levar ao aumento da ocupação de proteínas em RNAs.

A quantidade de RNA recuperado de RIPiT é geralmente baixa (0.5-10 pmoles, isto é, 10-250 ng RNA considerando um comprimento médio do RNA de 75 NT). A principal razão para isso é que apenas uma pequena fração de uma determinada proteína está presente no complexo com outras proteínas dentro de RNPs (qualquer “livre” proteína IP’ed na primeira etapa é perdida durante o segundo IP). Para gerar bibliotecas de RNA-Seq deste RNA, nós igualmente esboçamos aqui uma adaptação do protocolo previamente publicado apropriado para tais baixas entradas do RNA^15,16 (Figura 2), que rende amostras prontas de sequenciamento de alta produtividade em 3 Dias.