ランデムにおけるRNA免疫沈殿によるRNAタンパク質複合体の足跡の同定、シーケンシング(RIPiT-Seq)
Summary
ここでは、哺乳動物細胞由来のRNA:タンパク質(RNP)複合体の内因性RNA結合部位または「フットプリント」を濃縮するプロトコルを提示する。このアプローチは、RNPサブユニットの2つの免疫沈殿を伴い、したがって、並行してRNA免疫沈殿(RIPiT)と呼ばれています。
Abstract
タンデムにおけるRNA免疫沈殿(RIPiT)は、RNA:タンパク質(RNP)複合体内の一対のタンパク質のRNAフットプリントを濃縮する方法である。RIPiTは2つの精製ステップを採用しています。まず、タグ付きRNPサブユニットの免疫沈殿は、軽度のRNase消化およびその後の非回想性親和性溶出が続く。別のRNPサブユニットの第2の免疫沈殿は、定義された複合体の濃縮を可能にする。RNAおよびタンパク質の変性溶出に続いて、RNAフットプリントはハイスループットDNAシーケンシングライブラリーに変換されます。より一般的な紫外線(UV)架橋に続いて、RBP結合部位を濃縮する免疫沈殿(CLIP)アプローチとは異なり、RIPiTはUV架橋に依存しません。したがって、RIPiTはRNA相互作用に存在する多数のタンパク質に適用することができ、その先はRNA調節に不可欠であるが、RNAまたはUVクロスリンクに不十分に直接接触しない。RIPiTの2つの精製ステップは、目的のタンパク質が別の因子と連携して作用する結合部位を同定する付加的な利点を提供する。二重精製戦略はまた、背景を制限することによって信号を強化するのに役立ちます.ここでは、RIPiTを実行し、分離されたRNAフットプリントからハイスループットシーケンシングライブラリを生成するためのステップワイズ手順を提供します。また、RIPiTの利点とアプリケーションの概要を説明し、その制限事項について説明します。
Introduction
細胞内では、RNAはタンパク質と複合体内に存在し、RNA:タンパク質複合体(RAP)を形成します。RPは、RNA結合タンパク質(RRB、RNAを直接結合するもの)を中心に組み立てられますが、非RRB(RNAと結合するもので、RNAを結合しないもの)も含み、多くの場合、本質的に動的です。RRBとその共因子は、RRB内で一括して機能し、規制機能を実行します。例えば、ナンセンス媒介mRNA減衰(NMD)経路では、UPFタンパク質(UPF1、UPF2、およびUPF3b)は、早期に終了したリボソームを認識する。UPFタンパク質のそれぞれはRNAに結合することができますが、それらが一緒に組み立てるときだけ、活性NMD複合体が形成され始めます。この複合体内では、UPF1は非RBP SMG1によるリン酸化によってさらに活性化され、そのようなUPF1活性化は最終的にmRNA減衰誘導因子1、2の募集につながる。この例では、RBP は、NMD をトリガーする RNP 複合施設の採用およびアクティブ化に非 RBP 副要因を必要とします。RPのもう一つの性質は、その組成的不均一性である。異なる E、A、B、または C の複合体に存在するスプライセオソームを考えてみます。異なるスプリセオソーム複合体は、重複し、異なるタンパク質3を有する。RNP機能を研究するには、どのRNAがRBPとその関連タンパク質によって結合されているかを解明することが重要です。これを達成するために多くの方法が存在し、各アプローチには明確な長所と短所 4、5、6、7があります。
RBP結合部位を同定する広く一般的な方法-架橋に続いて免疫沈殿(CLIP)およびその様々なバリエーション – RBPをRNA8に架橋するために紫外線(UV)光に依存しています。ただし、これは、RNA に直接接触しない RP 内の非 RRB に対する効果的なアプローチではありません。ここでは、RNA 結合部位を分離して同定するために、RBP および非 RBP に適用可能な代替アプローチについて説明します。このアプローチは、連動してRNA免疫沈殿(RIPiT)と呼ばれる2つの免疫沈殿ステップからなり、単一の精製と比較してより高い特異性を達成するのに役立ちます(図1)9、10。個々の免疫沈殿(IP)ステップはCLIPと比較して低いストリンジェンシーで行うことができるので、RIPiTは免疫沈殿時に強い洗剤の存在に耐えることができる抗体の利用可能性に依存しない。RIPiTの最もユニークな利点は、2つの精製ステップで2つの異なるタンパク質を標的にする能力です。これは、他の同様の複合体11から組成的に異なるRNP複合体を豊かにする強力な方法を提供します。
RIPiTプロシージャへの小さなバリエーションは、RNP濃縮をさらに高めることができます。例えば、RP内のRNAタンパク質またはタンパク質とタンパク質の相互作用の一部は一過性であり、そのような複合体のフットプリントを効率的に精製することは困難である場合があります。このような相互作用を安定させるために、RPは細胞リシスおよびRIPiTの前にホルムアルデヒドと細胞内で架橋することができる。例えば、エキソン接合複合体(EJC)コア因子であるEIF4AIIIとEJC分解因子との間の弱い相互作用が、PYM12がより多くのRNAフットプリントが濃縮されるようなホルムアルデヒド処理で安定化できることを観察しました(データはが表示されます)。細胞採取およびRIPiTの前に、細胞はまた、特定の状態でRPを安定化または濃縮する薬物で治療することができる。例えば、翻訳中にmRNAから除去されるタンパク質を研究する場合(例えば、EJC 13、UPF114)、ピューロマイシン、シクロヘキシミドまたはハリントンチンなどの翻訳阻害剤による治療は、RNA上のタンパク質。
RIPiTから回収されるRNAの量は通常低い(0.5-10プレモル、すなわち、75 ntの平均RNA長を考慮して10〜250 ng RNA)。この主な理由は、特定のタンパク質のほんの一部のみがRP内の他のタンパク質と複合体内に存在する(第1ステップで行われた任意の「自由な」タンパク質IPが第2のIP中に失われる)。このRNAからRNA-Seqライブラリーを生成するために、我々はまた、このような低RNA入力に適した以前に公開されたプロトコルの適応を概説する 15,16 (図2), これは、3でハイスループットシーケンシング準備サンプルを得る日。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、RIPiT を正常に実行するための重要な考慮事項について説明します。何よりも、個々の IP を最適化して、各ステップで可能な限り高い効率を実現する必要があります。ここで説明する細胞の入力数に対するFLAGアガロースビーズの量は、我々がテストしたタンパク質の広い範囲に対して堅牢であることが証明されています。パートナータンパク質のほんの一部のみがFLAGタンパク質と?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、NIH助成金GM120209(GS)によってサポートされました。著者らは、OSUCCCゲノミクス共有リソースコアのサービス(CCCサポートグラントNCI P30 CA16058)に感謝しています。
Materials
| Anti-FLAG Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| ATP, [γ-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml EasyTide, 250µCi | PerkinElmer | BLU502A250UC | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (200) | Fisher | 14-823-435 | |
| Betaine 5M | Sigma | B0300 | |
| biotin-dATP | TriLink | N-5002 | |
| biotin-dCTP | Perkin Elmer | NEL540001EA | |
| Branson Sonifier, Model SSE-1 | Branson | ||
| CircLigase I | VWR | 76081-606 | ssDNA ligase I |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher | 11995-065 | |
| DNA load buffer NEB | NEB | ||
| Dynabeads Protein A | LifeTech | 10002D | |
| Flp-In-T-REx 293 Cell Line | ThermoFisher | R78007 | |
| GeneRuler Low Range DNA Ladder | ThermoScientific | FERSM1203 | |
| Hygromycin B | ThermoFisher | 10687010 | |
| Mini-PROTEAN TBE Gel 10 well | Bio-Rad | 4565013 | |
| Mini-PROTEAN TBE-Urea Gel | Bio-Rad | 4566033 | |
| miRCAT-33 adapter 5′-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGddC-3′ | Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| Mirus transIT-X2 transfection reagent | Mirus | MIR 6004 | |
| Mth RNA ligase | NEB | E2610S | |
| PE1.0 5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3′ |
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| PE2.0 5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTC GGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATC*T-3′ |
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| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1, pH 6.7, 100ml) | Fisher | BP1752I-100 | |
| Purple Gel Loading Dye (6x) | NEB | NEB #7025 | |
| Q5 DNA Polymerase | NEB | M0491S/L | |
| RNase I, E. coli, 1000 units | Eppicenter | N6901K | |
| SPIN-X column | Corning | CLS8160-24EA | |
| Streptavidin beads | ThermoFisher | 60210 | |
| Superscript III (SSIII) | ThermoScientific | 18080044 | reverse transcriptase enzyme |
| SybrGold | ThermoFisher | S11494 | gold nucleic acid gel stain |
| T4 Polynucleotide Kinase-2500U | NEB | M0201L | |
| T4RNL2 Tr. K227Q | NEB | M0351S | |
| Tetracycline | Sigma | 87128 | |
| Thermostable 5´ App DNA/RNA Ligase | NEB | M0319S | |
| TruSeq_SE1 5′-pGGCACTANNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
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| TruSeq_SE10 5′-pGGTGTTCNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
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| TruSeq_SE11 5′-pGGTAAGTNNNNNAGATCGGAA GAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE12 5′-pGGAGATGNNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE2 5′-pGGGTAGCNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
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| TruSeq_SE35′-pGGTCGATNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE4 5′-pGGCCTCGNNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE5 5′-pGGTGACANNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE6 5′-pGGTAGACNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE7 5′-pGGGCCCTNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCT TCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE8 5′-pGGATCGGNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTT CCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE9 5′-pGGACTGANNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| Typhoon 5 Bimolecular Imager | GE Healthcare Life Science | 29187191 |
References
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