Идентификация следов РНК:Белковые комплексы через РНК иммунопреципиция в Тандеме После секвенирования (RIPiT-Seq)

Внутри клеток РНК существует в комплексе с белками для формирования РНК:белковых комплексов (РНК). RNPs собраны вокруг белков связывания РНК (RBPs, те, которые непосредственно связывают РНК), но также состоят из не-RBPs (те, которые связывают RBPs, но не РНК), и часто динамические по своему характеру. РРП и их кофакторы коллективно функционируют в рамках РСП для выполнения регулятивных функций. Например, в пути распада мРНК (NMD) upF белки UPF (UPF1, UPF2 и UPF3b) распознают преждевременно прекращенную рибосому. Каждый из белков UPF может связываться с РНК, но только тогда, когда они собираются вместе, что активный комплекс NMD начинает формироваться. В рамках этого комплекса, UPF1 дополнительно активируется фосфорилированием не-RBP SMG1, и такая активация UPF1 в конечном итоге приводит к набору мРНК распада индуцирующих факторов^1,2. В этом примере РБП требуют кофакторов, не относясь от RBP, для набора и активации комплекса RNP, который запускает НМД. Еще одним свойством РНП является их композиционная неоднородность. Рассмотрим сплайсесом, который существует в различных комплексах E, A, B или C. Различные сплайсцеосомные комплексыимеют перекрывающиеся и различные белки 3. Для изучения функций RNP важно выяснить, какие РНК связаны RBP и связанными с ним белками. Многие методы существуют для достижения этой цели, скаждым подходом, имеющим свои отличительные преимущества и недостатки 4,^5,6,7.

Широко популярные методы для определения RBP связывающих сайтов – перекрестные с последующими иммунопрецицией (CLIP) и его различные вариации – полагаться на ультрафиолетовый (УФ) свет для перекрестного RBP к РНК⁸. Тем не менее, это не является эффективным подходом для не-RBPs в рамках RNPs, которые не связываются с РНК напрямую. Здесь мы описываем альтернативный подход, применимый как к RBP, так и к не-RBPs, чтобы изолировать и идентифицировать их сайты связывания РНК. Этот подход называется РНК иммунопрецитификации в тандеме (RIPiT) состоит из двух иммунопреципции шаги, которые помогают достичь более высокой специфичности по сравнению с одной очистки (Рисунок 1)^9,10. Поскольку индивидуальные иммунопретенции (Ip) шаги могут быть выполнены на более низкой строгости по сравнению с CLIP, RIPiT не зависит от наличия антител, которые могут выдержать наличие сильных моющих средств во время иммунопреципиции. Самым уникальным преимуществом RIPiT является способность нацеливают два разных белка на два этапа очистки; это обеспечивает мощный способ обогатить композиционно различные RNP комплекса из других подобных комплексов¹¹.

Небольшие изменения в процедуре RIPiT могут способствовать дальнейшему обогащению РНП. Например, некоторые взаимодействия РНК-белка или белка в РНП являются временными, и может быть трудно эффективно очищать следы таких комплексов. Для стабилизации таких взаимодействий, RNPs могут быть перекрестными внутри клеток с формальдегидом до лизиса клетки и RIPiT. Например, мы заметили, что слабое взаимодействие между основным фактором экзон-соединения (EJC) (EJC) и фактором разборки EJC, PYM¹² может быть стабилизировано с помощью обработки формальдегида таким образом, что больше следов РНК обогащается (данные не показано). До сбора клеток и RIPiT, клетки также могут быть обработаны препаратами для стабилизации или обогащения RNPs в определенном состоянии. Например, при изучении белков, которые удаляются из мРНК во время перевода (например, EJC^13,UPF1^14),лечение ингибиторами перевода, такими как пуромицин, циклогексимид или харрингтонин, может привести к увеличению заполняемости белки на РНК.

Количество РНК, извлеченных из RIPiT, как правило, является низким (0,5-10 pmoles, т.е. 10-250 нг РНК с учетом средней длины РНК 75 nt). Основная причина этого заключается в том, что лишь малая часть данного белка присутствует в комплексе с другими белками в РНП (любой “свободный” белок IP’ed на первом этапе теряется во время второго IP). Для создания библиотек RNA-Seq из этой РНК, мы также наметить здесь адаптацию ранее опубликованного протокола подходит для таких низких входов РНК^15,16 (Рисунок2), который дает высокой пропускной способности секвенирования готовых образцов в 3 Дней.