Identificación de Huellas de ARN:Complejos proteicos a través de la inmunoprecipitación de ARN en tándem seguido de secuenciación (RIPiT-Seq)

Dentro de las células, el ARN existe en complejos con proteínas para formar complejos de ARN:proteínas (RNPs). Los RRP se ensamblan alrededor de proteínas de unión al ARN (RBP, aquellas que unen directamente el ARN) pero también comprenden los RBP no (aquellos que unen los PBP pero no el ARN), y a menudo son dinámicos en la naturaleza. Los BBP y sus cofactores funcionan colectivamente dentro de los RNP para ejecutar funciones regulatorias. Por ejemplo, en la vía de descomposición del ARNm mediado por tonterías (NMD), las proteínas UPF (UPF1, UPF2 y UPF3b) reconocen el ribosoma terminado prematuramente. Cada una de las proteínas UPF puede unirse al ARN, pero es sólo cuando se ensamblan juntas que comienza a formarse un complejo NMD activo. Dentro de este complejo, UPF1 se activa aún más por fosforilación por un SMG1 no RBP, y dicha activación UPF1 eventualmente conduce a la contratación de factores inductores de descomposición de ARNm^1,2. En este ejemplo, los RBP requieren cofactores que no son DeRBP para el reclutamiento y la activación del complejo RNP que activa NMD. Otra propiedad de los RNPs es su heterogeneidad compositiva. Considere el spliceosoma, que existe en los complejos distintos E, A, B o C. Diferentes complejos de spliceos tienenproteínas superpuestas y distintas 3. Para estudiar las funciones de RNP, es importante dilucidar qué ARN están unidos por una RBP y sus proteínas asociadas. Existen muchos métodos para lograrlo, con cada enfoque teniendo sus claras ventajas y desventajas^4,5,6,7.

Los métodos más populares para identificar los sitios de unión de la RBP —reticulación seguido de inmunoprecipitación (CLIP) y sus diversas variaciones— dependen de la luz ultravioleta (UV) para cruzar una RBP al ARN^8. Sin embargo, este no es un enfoque eficaz para los no RBP dentro de los RMP, que no entran en contacto directamente con el ARN. Aquí, describimos un enfoque alternativo que es aplicable a los BBP y no BBP por igual, para aislar e identificar sus sitios de enlace de ARN. Este enfoque llamado inmunoprecipitación de ARN en tándem (RIPiT) consta de dos pasos de inmunoprecipitación, que ayudan a lograr una mayor especificidad en comparación con una sola purificación (Figura1)^9,10. Como los pasos de inmunoprecipitación individual (IP) se pueden llevar a cabo con una cuerda más baja en comparación con CLIP, RIPiT no depende de la disponibilidad de anticuerpos que puedan soportar la presencia de detergentes fuertes durante la inmunoprecipitación. La ventaja más singular de RIPiT es la capacidad de apuntar a dos proteínas diferentes en dos pasos de purificación; esto proporciona una manera poderosa de enriquecer un complejo RNP diferenciado compositivamente de otros complejos similares^11.

Pequeñas variaciones en el procedimiento RIPiT pueden mejorar aún más el enriquecimiento de RNP. Por ejemplo, algunas interacciones ARN-proteína o proteína-proteína dentro de los RNPs son transitorias y puede ser difícil purificar eficientemente las huellas de estos complejos. Para estabilizar tales interacciones, los RNP pueden ser reticulados dentro de las células con formaldehído antes de la lisis celular y RIPiT. Por ejemplo, hemos observado que una interacción débil entre el factor de núcleo del complejo de unión exón (EJC), EIF4AIII y el factor de desmontaje del EJC, PYM¹² puede estabilizarse con el tratamiento de formaldehído de modo que se enriquezcan más huellas de ARN (datos no se muestra). Antes de la cosecha celular y RIPiT, las células también pueden ser tratadas con medicamentos para estabilizar o enriquecer los RMP en un estado particular. Por ejemplo, cuando se estudian proteínas que se eliminan del ARNm durante la traducción (por ejemplo, el EJC¹³, UPF1¹⁴), el tratamiento con inhibidores de la traducción como la puromicina, la cicloheximida o la harringtonina puede proteínas en los ARN.

La cantidad de ARN recuperada de RIPiT suele ser baja (0,5-10 pmoles, es decir, 10-250 ng de ARN teniendo una longitud media de ARN de 75 nt). La razón principal de esto es que sólo una pequeña fracción de una proteína dada está presente en complejo con otras proteínas dentro de los NRP (cualquier proteína “libre” IP’ed en el primer paso se pierde durante el segundo IP). Para generar bibliotecas RNA-Seq a partir de este ARN, también describimos aquí una adaptación del protocolo publicado anteriormente adecuado para tales entradas de ARN bajas^15,16 (Figura2), que produce muestras listas para secuenciación de alto rendimiento en 3 Días.