Identifizierung von Fußabdrücken von RNA:Protein-Komplexe über RNA-Immunpräzipitation im Tandem gefolgt von Sequenzierung (RIPiT-Seq)

Innerhalb von Zellen existiert RNA in komplexen Proteinen, um RNA:Protein-Komplexe (RNPs) zu bilden. RNPs werden um RNA-bindende Proteine (RBPs, die RNA direkt binden) zusammengesetzt, bestehen aber auch aus Nicht-RBPs (die RBPs binden, aber nicht RNA) und sind oft dynamischer Natur. RBPs und ihre Cofactors arbeiten gemeinsam innerhalb von RNPs, um regulierungsrechtliche Funktionen auszuführen. Beispielsweise erkennen die UPF-Proteine (UPF1, UPF2 und UPF3b) im unsinnvermittelten mRNA-Zerfallsweg (NMD) das vorzeitig beendete Ribosom. Jedes der UPF-Proteine kann an RNA binden, aber erst wenn sie sich zusammensetzen, beginnt sich ein aktiver NMD-Komplex zu bilden. Innerhalb dieses Komplexes wird UPF1 durch Phosphorylierung durch ein Nicht-RBP SMG1 weiter aktiviert, und eine solche UPF1-Aktivierung führt schließlich zur Rekrutierung von mRNA-Zerfallsinduzierenden Faktoren^1,2. In diesem Beispiel benötigen RBPs Nicht-RBP-Cofaktoren für die Rekrutierung und Aktivierung des RNP-Komplexes, der NMD auslöst. Eine weitere Eigenschaft von RNPs ist ihre kompositorische Heterogenität. Betrachten wir den Spliceosome, der in unterschiedlichen E-, A-, B- oder C-Komplexen existiert. Verschiedene spliceosome komplexe haben überlappende und unterschiedliche Proteine³. Um RNP-Funktionen zu untersuchen, ist es wichtig zu klären, welche RNAs durch ein RBP und die zugehörigen Proteine gebunden sind. Viele Methoden existieren, um dies zu erreichen, wobei jeder Ansatz seine deutlichen Vor- und Nachteile^4,5,6,7hat.

Die weit verbreiteten Methoden zur Identifizierung von RBP-Bindungsstellen – Vernetzung gefolgt von Immunpräzipitation (CLIP) und seinen verschiedenen Variationen – verlassen sich auf ultraviolettes (UV) Licht, um ein RBP mit RNA⁸zu vernetzen. Dies ist jedoch kein effektiver Ansatz für Nicht-RBPs innerhalb von RNPs, die die RNA nicht direkt kontaktieren. Hier beschreiben wir einen alternativen Ansatz, der für RBPs und Nicht-RBPs gleichermaßen gilt, um ihre RNA-Bindungsstellen zu isolieren und zu identifizieren. Dieser Ansatz, der als RNA-Immunpräzipitation im Tandem (RIPiT) bezeichnet wird, besteht aus zwei Immunpräzipitationsschritten, die dazu beitragen, eine höhere Spezifität im Vergleich zu einer einzigen Reinigung zu erreichen (Abbildung 1)^9,10. Da die einzelnen Immunpräzipitationsschritte (IP) mit einer geringeren Stringenz im Vergleich zu CLIP durchgeführt werden können, hängt RIPiT nicht von der Verfügbarkeit von Antikörpern ab, die das Vorhandensein starker Detergenzien während der Immunpräzipitation aushalten können. Der einzigartigste Vorteil von RIPiT ist die Fähigkeit, zwei verschiedene Proteine in zwei Reinigungsschritten anzuvisieren; Dies bietet eine leistungsstarke Möglichkeit, einen kompositorisch unterschiedlichen RNP-Komplex aus anderen ähnlichen Komplexen zu bereichern¹¹.

Kleine Variationen des RIPiT-Verfahrens können die RNP-Anreicherung weiter verbessern. Zum Beispiel sind einige RNA-Protein- oder Protein-Protein-Wechselwirkungen innerhalb von RNPs vorübergehend und es kann schwierig sein, Fußabdrücke solcher Komplexe effizient zu reinigen. Um solche Wechselwirkungen zu stabilisieren, können RNPs innerhalb von Zellen mit Formaldehyd vor der Zelllyse und RIPiT vernetzt werden. Zum Beispiel haben wir beobachtet, dass eine schwache Wechselwirkung zwischen dem Exon-Junction-Komplex (EJC)-Kernfaktor EIF4AIII und dem EJC-Demontagefaktor PYM¹² mit Formaldehyd-Behandlung stabilisiert werden kann, so dass mehr RNA-Fußabdrücke angereichert werden (Daten nicht angezeigt). Vor der Zellernte und RIPiT können Zellen auch mit Medikamenten behandelt werden, um RNPs in einem bestimmten Zustand zu stabilisieren oder anzureichern. Wenn beispielsweise Proteine untersucht werden, die während der Translation aus der mRNA entfernt werden (z. B. eJC¹³, UPF1¹⁴), kann die Behandlung mit Translationshemmern wie Puromycin, Cycloheximid oder Harringtonin zu einer erhöhten Belegung von Proteine auf RNAs.

Die Menge der von RIPiT zurückgewonnenen RNA ist in der Regel gering (0,5-10 Pmole, d.h. 10-250 ng RNA unter Berücksichtigung einer durchschnittlichen RNA-Länge von 75 nt). Der Hauptgrund dafür ist, dass nur ein kleiner Bruchteil eines bestimmten Proteins in Komplex mit anderen Proteinen innerhalb von RNPs vorhanden ist (jedes “freie” Protein IP’ed im ersten Schritt geht während des zweiten IP verloren). Um aus dieser RNA RNA-Seq-Bibliotheken zu generieren, skizzieren wir hier auch eine Anpassung des zuvor veröffentlichten Protokolls, das für solche niedrigen RNA-Eingänge geeignet ist^15,16 (Abbildung 2), was zu hochdurchsatzbereiten Proben in 3 Tage.