Isolatie van speeksel epitheelcellen van menselijke speekselklieren voor in vitro groei als Salispheres of monolagen

Bij zoogdieren zijn de speekselklieren ingedeeld in 3 paar grote speekselklieren: de parotid, submandibulaire en sublinguale klieren. Er bestaat ook een reeks van kleine klieren gelegen op de tong en verspreid over de mondholte¹. De belangrijkste klieren zijn verantwoordelijk voor het bulk volume van speeksel geproduceerd². Naast het verstrekken van antimicrobiële bescherming door uitgescheiden factoren, het speeksel is belangrijk in het proces van kauwen en smeren van voedsel als het passeert de slokdarm². Als zodanig, speekselklier dysfunctie vertegenwoordigt een medisch probleem waarbij patiënten die niet in staat zijn om voldoende speeksel te produceren meer vatbaar zijn voor het ontwikkelen van maladies zoals tandheelkundige holten of orale candidiasis³. Bovendien, verminderde speeksel resulteert in grotere moeilijkheden eten en verteerd voedsel met een aanzienlijke invloed op de kwaliteit van leven.

De speekselklier dysfunctie is voornamelijk te vinden bij patiënten die lijden aan het syndroom van Sjögren, een auto-immuunstoornis of bij patiënten met hoofd-en nekkanker die bestraling van^{3,4,5, 6}. Beschadigde secretoire acini binnen de klieren als gevolg van auto-immuniteit of bestralingstherapie ondergaan geen zelf vernieuwing, wat resulteert in een patiënt leven met onherstelbare schade⁶. De studie van de speekselklieren heeft ook de aandacht of onderzoekers geïnteresseerd in mechanismen van virale pathogenese gegarnerd. Sommige pathogenen, zoals humaan cytomegalovirus (hcmv), voortdurend repliceren binnen de speekselklieren, die vervolgens het mogelijk maakt voor de overdracht van ontluikende virus naar een nieuwe gastheer via speeksel^7,8. Zo is er een onvervulde behoefte om robuuste en reproduceerbare in vitro modellen van speekselklier weefsel te ontwikkelen om een divers scala aan medische problemen aan te pakken en te begrijpen.

Verschillende modellen van het Murine speekselklier systeem zijn gebruikt als uitgangspunt voor het begrijpen en karakteriseren van de verschillende epitheelcellen die de speekselklieren vormen^9,10. Er bestaan duidelijke en grote verschillen tussen menselijke en muriene speekselklieren¹¹. Met name de humane holte klier is groter ten opzichte van de submandibulaire klier, terwijl de muis submandibulaire en holte veel vergelijkbaar zijn in grootte^1,2,11. Terwijl vereeuwigd menselijke submandibulaire cellijnen bestaat, er zijn grote bezorgdheid dat de vereeuwigd cellen niet nauwkeurig het fenotype van het primaire weefsel en secundaire bezorgdheid dat de vereeuwigd cellen niet daadwerkelijk worden afgeleid van speeksel epitheel zelf¹². Om deze redenen is er een belang en een noodzaak om primaire speeksel weefsel van de mens te bestuderen.

Hier beschrijven we een protocol om primaire epitheliale cellen te isoleren van menselijke speekselklieren voor weefselkweek. Ons protocol is gebaseerd op de werken van Pringle et al. en Tran et al. met wijzigingen die zijn aangebracht om hun procedures over het algemeen te vereenvoudigen^13,14. Ten eerste, terwijl het Protocol van Tran et al. vraagt om een lange incubatietijd van vijf uur voor enzymatisch verteren van het speeksel weefsel, is ons gewijzigde protocol succesvol geweest met zo weinig als een incubatie van één uur, vergelijkbaar met die in Pringle et al. Ten tweede gebruiken we verschillende enzymen voor de spijsvertering van weefsels, met name we gebruiken geen trypsine zoals wordt gebruikt in het oorspronkelijke Tran et al.-Protocol, maar in plaats daarvan een mengsel van dispase en Collagenase gebruiken. We voorkomen dat trypsine in de eerste digestie stappen als een recente studie suggereerde dat de initiële vertering van het speeksel weefsel door trypsine resulteert in verminderde levensvatbaarheid van de cel, mogelijk door het verlies van een zeldzame stamcel populatie¹⁵. Ten slotte cultuur we de salispheres op het oppervlak van de kelder membraan matrix (BMM) met behulp van een commercieel beschikbare media oorspronkelijk geformuleerd voor de voortplanting van bronchiale epitheelcellen. Ons protocol kan worden gebruikt om speeksel cellen te isoleren van parotid, submandibulaire en sublinguale klieren. Deze cellen Express speeksel amylase en andere speeksel specifieke genen die erop wijzen dat ze een fenotype vergelijkbaar met dat van speeksel acineuze epitheelcellen⁷. We hebben met succes speeksel culturen gegenereerd uit > 50 primaire menselijke weefselmonsters met behulp van deze methodologie. Bovendien kunnen de primaire speeksel cellen gemakkelijk worden cryopreserved voor gebruik op een later tijdstip.