Isolação de pilhas epithelial salivares das glândulas salivares humanas para o crescimento in vitro como Salispheres ou monolayers

Em mamíferos, as glândulas salivares são organizadas em 3 pares de glândulas salivares principais: as glândulas parótida, submandibular e sublingual. Existe também uma série de glândulas menores localizadas na língua e espalhadas por toda a cavidade oral¹. As glândulas principais são responsáveis para o volume de maioria de saliva produziu². Além de fornecer proteção antimicrobiana por meio de fatores secretados, a saliva é importante no processo de mastigação e lubrificação de alimentos à medida que passa pelo esôfago². Como tal, a disfunção da glândula salivar representa um problema médico em que os doentes que são incapazes de produzir saliva suficiente são mais propensos a desenvolver doenças, como cavidades dentárias ou candidíase oral³. Adicionalmente, a redução da saliva resulta em maior dificuldade em comer e digerir os alimentos com um impacto significativo na qualidade de vida.

A disfunção da glândula salivar é encontrada principalmente em pacientes que sofrem de síndrome de Sjögren, uma desordem auto-imune, ou em pacientes com câncer de cabeça e pescoço que passaram por terapia de irradiação^3,4,^5, a ⁶. O ácinos secretora danificado dentro das glândulas em conseqüência da autoimunidade ou da terapia de radiação não se submete à autorenovação, que conduz a um paciente que vive com dano irreversível⁶. O estudo das glândulas salivares também tem ganhou a atenção ou pesquisadores interessados em mecanismos de patogênese viral. Alguns patógenos, como o citomegalovírus humano (HCMV), persistentemente replicam dentro das glândulas salivares, o que permite a transmissão do vírus nascente para um novo hospedeiro via saliva^7,8. Assim, há uma necessidade não satisfeita de desenvolver modelos in vitro robustos e reprodutíveis do tecido da glândula salivar para abordar e compreender uma disposição diversa de problemas médicos.

Vários modelos do sistema de glândula salivar Murina têm sido utilizados como ponto de partida para compreender e caracterizar as diferentes células epiteliais que formam as glândulas salivares^9,10. Existem diferenças óbvias e importantes entre as glândulas salivares humanas e murinas¹¹. Mais notavelmente, a glândula parótida humana é maior em relação à glândula submandibular, enquanto o camundongo submandibular e a parótida são muito semelhantes no tamanho^1,2,11. Quando as linhas de pilha submandibular humanas imortalizado existirem, há umas preocupações principais que as pilhas imortalized não mantêm exatamente o phenotype do tecido preliminar e das preocupações secundárias que as pilhas imortalized não são derivadas realmente do epitélio salivar próprio¹². Por estas razões há um interesse e uma necessidade de estudar o tecido salivar preliminar dos seres humanos.

Aqui nós descrevemos um protocolo para isolar pilhas epithelial preliminares das glândulas salivares humanas para a cultura do tecido. Nosso protocolo é baseado nas obras de Pringle et al. e Tran et al. com modificações feitas para simplificar geralmente seus procedimentos^13,14. Primeiro, enquanto o protocolo de Tran et al. exige uma longa incubação de cinco horas para digerir enzimaticamente o tecido salivar, nosso protocolo modificado tem sido bem-sucedido com pouco tempo de incubação de uma hora, semelhante ao de Pringle et al. Em segundo lugar, nós usamos enzimas diferentes para a digestão do tecido, o mais notàvelmente nós não usamos o tripsina como é usado no protocolo original de Tran et al., mas usamos uma mistura do Dispase e do Collagenase. Nós preferimos evitar o tripsina nas etapas iniciais da digestão como um estudo recente sugeriu que a digestão inicial do tecido salivar pela tripsina resulte na viabilidade reduzida da pilha, possivelmente pela perda de uma população rara da pilha de haste¹⁵. Por fim, nós cultive os salispheres na superfície da matriz da membrana do porão (BMM) usando meios comercialmente disponíveis originalmente formulados para a propagação de pilhas epithelial brônquicas. Nosso protocolo pode ser usado para isolar as células salivares das glândulas parótidas, submandibulares e sublinguais. Estas pilhas expressam a amilase salivar e outros genes específicos salivares que indicam que mantêm um phenotype similar àquele de pilhas epithelial acinar salivares⁷. Nós geramos com sucesso culturas salivares de > 50 amostras preliminares do tecido humano usando esta metodologia. Além disso, as pilhas salivares preliminares podem facilmente ser cryopreservado para o uso em uma data mais atrasada.