Aislamiento de células epiteliales salivales de glándulas salivales humanas para el crecimiento in vitro como salisferas o monocapas

En los mamíferos, las glándulas salivales se organizan en 3 pares de glándulas salivales principales: las glándulas parótidas, submandibulares y sublinguales. También existe una serie de glándulas menores ubicadas en la lengua y dispersas por toda la cavidad oral¹. Las glándulas principales son responsables del volumen mayor de saliva producida². Además de proporcionar protección antimicrobiana a través de factores secretos, la saliva es importante en el proceso de masticar y lubricar los alimentos a medida que pasa a través del esófago². Como tal, la disfunción de la glándula salival representa un problema médico donde los enfermos que son incapacesde producir suficiente saliva son más propensos a desarrollar enfermedades como caries dentales o candidiasis oral 3. Además, la reducción de la saliva da como resultado una mayor dificultad para comer y digerir los alimentos que tienen un impacto significativo en la calidad de vida.

La disfunción de la glándula salival se encuentra principalmente en pacientes que sufren del síndrome de Sjogren, un trastorno autoinmune, o en pacientes con cáncer de cabeza y cuello que se han sometido a terapia de irradiación^{3,4,5, 6}. El secretor dañado acini dentro de las glándulas como resultado de la autoinmunidad o radioterapia no se somete a la auto-renovación, lo que resulta en un paciente que vive con daños irreversibles⁶. El estudio de las glándulas salivales también ha atraído la atención o investigadores interesados en los mecanismos de la patogénesis viral. Algunos patógenos, como el citomegalovirus humano (HCMV), se replican persistentemente dentro de las glándulas salivales, lo que permite la transmisión del virus naciente a un nuevo huésped a través de la saliva^7,8. Por lo tanto, existe una necesidad insatisfecha de desarrollar modelos in vitro robustos y reproducibles de tejido de la glándula salival para abordar y entender una amplia gama de problemas médicos.

Varios modelos del sistema de glándulas salivales murinas se han utilizado como punto de partida paracomprender y caracterizar las diferentes células epiteliales que forman las glándulas salivales 9,^10. Existen diferencias obvias y importantes entre las glándulas salivales humanas y murinas^11. Más notablemente la glándula parótida humana es más grande en relación con la glándula submandibular mientras que el ratón submandibular y parótido son muy similares en tamaño^1,2,11. Si bien existen líneas celulares submandibulares humanas inmortalizadas, hay grandes preocupaciones de que las células inmortalizadas no mantengan con precisión el fenotipo del tejido primario y las preocupaciones secundarias de las que las células inmortalizadas no se derivan realmente epitelio salival en sí¹². Por estas razones hay un interés y una necesidad de estudiar el tejido salival primario de los seres humanos.

Aquí describimos un protocolo para aislar las células epiteliales primarias de las glándulas salivales humanas para el cultivo de tejidos. Nuestro protocolo se basa en las obras de Pringle et al. y Tran et al. con modificaciones realizadas para simplificar generalmente sus procedimientos^13,14. En primer lugar, mientras que el protocolo de Tran et al. requiere una larga incubación de cinco horas para digerir enzimáticamente el tejido salival, nuestro protocolo modificado ha tenido éxito con tan solo una hora de incubación, similar a la de Pringle et al. En segundo lugar, utilizamos diferentes enzimas para la digestión de los tejidos, sobre todo no usamos la trippsina como se utiliza en el protocolo original De tran et al., sino que usamos una mezcla de dispensa y colagenasa. Preferimos evitar la trippsina en los pasos iniciales de digestión como un estudio reciente sugirió que la digestión inicial del tejido salival por trippsina resulta en una menor viabilidad celular, posiblemente por la pérdida de una población rara de células madre¹⁵. Por último, cultivamos las salisferas en la superficie de la matriz de membrana del sótano (BMM) utilizando un medio disponible comercialmente formulado originalmente para la propagación de células epiteliales bronquiales. Nuestro protocolo se puede utilizar para aislar las células salivales de las glándulas parótidas, submandibulares y sublinguales. Estas células expresan la amilasa salival y otros genes salivales específicos que indican que mantienen un fenotipo similar al de las células epiteliales del acinar salival⁷. Hemos generado con éxito cultivos salivales a partir de >50 muestras primarias de tejido humano utilizando esta metodología. Además, las células salivales primarias se pueden crioreservar fácilmente para su uso en una fecha posterior.