Isolierung von Speicheldrüsenepithelzellen aus menschlichen Speicheldrüsen für In-Vitro-Wachstum als Speicheldrüsen oder Monolayer

Bei Säugetieren sind die Speicheldrüsen in 3 Paare von Hauptspeicheldrüsen organisiert: die Ohrspeicheldrüsen, submandibulären und sublingualen Drüsen. Es gibt auch eine Reihe von kleineren Drüsen auf der Zunge und verstreut in der Mundhöhle¹. Die Hauptdrüsen sind verantwortlich für das Massenvolumen des erzeugten Speichels². Neben dem antimikrobiellen Schutz durch sezernierte Faktoren ist der Speichel wichtig für den Prozess des Kauens und Schmierens von Lebensmitteln, während er durch die Speiseröhre geht². Als solche, Speicheldrüsenfunktionsstörungen stellt ein medizinisches Problem, wo Betroffene, die nicht in der Lage sind, genug Speichel zu produzieren sind anfälliger für die Entwicklung von Krankheiten wie Zahnhöhlen oder orale Candidiasis³. Darüber hinaus führt reduzierter Speichel zu größeren Schwierigkeiten beim Essen und Verdauen von Lebensmitteln, die einen erheblichen Einfluss auf die Lebensqualität haben.

Speicheldrüsenfunktionsstörungen finden sich vor allem bei Patienten mit Sjögren-Syndrom, einer Autoimmunerkrankung oder bei Patienten mit Kopf- und Nackenkrebs, die einer Bestrahlungstherapie unterzogen wurden^{3,4,5, 6}. Beschädigte sekretotische Acini in den Drüsen als Folge von Autoimmunität oder Strahlentherapie unterziehen sich keiner Selbsterneuerung, was dazu führt, dass ein Patient mit irreversiblen Schäden lebt⁶. Die Untersuchung von Speicheldrüsen hat auch die Aufmerksamkeit oder Forscher, die an Mechanismen der viralen Pathogenese interessiert. Einige Krankheitserreger, wie das menschliche Zytomegalievirus (HCMV), replizieren sich hartnäckig innerhalb der Speicheldrüsen, was dann die Übertragung des entstehenden Virus auf einen neuen Wirt über Speichel^7,8ermöglicht. Daher besteht ein unerfülltes Bedürfnis, robuste und reproduzierbare In-vitro-Modelle von Speicheldrüsengewebe zu entwickeln, um eine Vielzahl medizinischer Probleme anzugehen und zu verstehen.

Mehrere Modelle des murinen Speicheldrüsensystems wurden als Ausgangspunkt verwendet, um die verschiedenen Epithelzellen zu verstehen und zu charakterisieren, die die Speicheldrüsen^9,10bilden. Es gibt offensichtliche und große Unterschiede zwischen menschlichen und murinen Speicheldrüsen¹¹. Vor allem die menschliche Ohrspeicheldrüse ist größer im Verhältnis zur submandibulären Drüse, während die Maus submanddibuläre und Ohrspeicheldrüse sind viel ähnlich in Größe^1,2,11. Während verewigte menschliche submandibuläre Zelllinien existieren, gibt es große Bedenken, dass die verewigten Zellen den Phänotyp des primären Gewebes nicht genau aufrechterhalten, und sekundäre Bedenken, dass die verewigten Zellen nicht tatsächlich von Speichelepithel selbst¹². Aus diesen Gründen gibt es ein Interesse und die Notwendigkeit, primäre speicheldrüsengewebe vom Menschen zu studieren.

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung primärer Epithelzellen aus menschlichen Speicheldrüsen für die Gewebekultur. Unser Protokoll basiert auf den Arbeiten von Pringle et al. und Tran et al. mit Änderungen, die vorgenommen wurden, um ihre Verfahren generell zu vereinfachen^13,14. Erstens: Während das Protokoll von Tran et al. eine lange fünfstündige Inkubation zur enzymatischen Verdauung des Speicheldrüsengewebes fordert, war unser modifiziertes Protokoll mit nur einer Stunde Inkubation erfolgreich, ähnlich wie in Pringle et al. Zweitens verwenden wir verschiedene Enzyme für die Gewebeverdauung, vor allem verwenden wir Trypsin nicht, wie es im ursprünglichen Tran et al.-Protokoll verwendet wird, sondern verwenden eine Mischung aus Dispase und Kollagennase. Wir ziehen es vor, Trypsin in den ersten Verdauungsschritten zu vermeiden, da eine aktuelle Studie nahelegte, dass die Erstverdauung des Speichelgewebes durch Trypsin zu einer verminderten Zelllebensfähigkeit führt, möglicherweise durch den Verlust einer seltenen Stammzellpopulation¹⁵. Schließlich bewirtschaften wir die Salisphären auf der Oberfläche der Kellermembranmatrix (BMM) mit einem kommerziell erhältlichen Medium, das ursprünglich für die Ausbreitung von Bronchialepithelzellen entwickelt wurde. Unser Protokoll kann verwendet werden, um Speicheldrüsenzellen aus Ohrspeicheldrüsen, submandibulären und sublingualen Drüsen zu isolieren. Diese Zellen drücken Speicheldrüsenamylase und andere Speicheldrüsen-spezifische Gene aus, was darauf hindeutet, dass sie einen Phänotyp beibehalten, der dem von Speicheldrüsen-Acinar-Epithelzellen^{ähnelt 7}. Mit dieser Methode haben wir erfolgreich Speicheldrüsenkulturen aus >50 primären menschlichen Gewebeproben erzeugt. Darüber hinaus können die primären Speicheldrüsenzellen leicht kryokonserviert werden, um sie zu einem späteren Zeitpunkt zu verwenden.