Изоляция слюнных эпителиальных клеток от слюнных желез человека для роста провитроки как салисферы или монослои
Summary
Мы представляем метод изоляции и культивирования первичных клеток эпителии, полученных из слюнных желез человека. Эти клетки демонстрируют модели экспрессии генов, согласующиеся с их слюнным эпителиальным происхождением, и могут быть выращены в виде салисферов на мембранных матрицах подвала, полученных из опухолевых клеток Энгельбрета-Хольма-Срой или в качестве монослойных на обработанных культурных блюдах.
Abstract
Слюнные железы являются местом значительный интерес для исследователей, заинтересованных в различных аспектах болезни человека. Одной из целей исследователей является восстановление функции желез, поврежденных лучевой терапией или из-за патологий, связанных с синдромом Шегрена. Вторая цель исследователей заключается в определении механизмов, с помощью которых вирусы размножаются в железистой ткани, где они могут затем получить доступ к слюнных жидкостей, важных для горизонтальной передачи. Эти цели подчеркивают необходимость надежной и доступной модели слюнных желез in vitro, которая может быть использована исследователями, заинтересованными в вышеупомянутых, а также смежных областях исследований. Здесь мы обсуждаем простой протокол для изоляции эпителиальных клеток из человеческих слюнных желез и распространять их в пробирке. Наш протокол может быть дополнительно оптимизирован для удовлетворения потребностей отдельных исследований. Вкратце, слюнная ткань механически и enzymatically отделена к изолировать одиночные клетки или малые кластеры клеток. Выбор эпителиальных клеток происходит путем покрытия на подвальной мембранной матрицы в присутствии средств оптимизированы для содействия росту эпителиальных клеток. Эти образовываемые культуры можно поддерживать как трехмерные кластеры, называемые «салисферами», или выращенные в качестве монослойного на обработанных блюдах культуры пластиковой ткани. Этот протокол приводит к росту неоднородной популяции в основном эпителиальных клеток, которые могут распространяться в течение 5-8 проходов (15-20 удвоений населения) до прохождения клеточного сенесценции.
Introduction
У млекопитающих слюнные железы организованы в 3 пары основных слюнных желез: околоушные, подчелюстные и сублингвальные железы. Существует также ряд мелких желез, расположенных на языке и разбросанных по всей полости рта1. Основные железы несут ответственность за объем слюны производится2. В дополнение к обеспечению защиты противомикробных препаратов с помощью секретных факторов, слюна имеет важное значение в процессе жевания и смазки пищи, как она проходит через пищевод2. Таким образом, дисфункция слюнных желез представляет собой медицинский вопрос, где больные, которые не в состоянии производить достаточно слюны более склонны к развитию заболеваний, таких как полости зубов или устного кандидоза3. Кроме того, снижение слюны приводит к большей сложности еды и переваривания пищи, что оказывает значительное влияние на качество жизни.
Дисфункция слюнных желез в первую очередь встречается у пациентов, страдающих синдромом Шегрена, аутоиммунным расстройством, или у пациентов с раком головы и шеи, которые подверглись лучевой терапии3,4,5, 6. Поврежденные секреторные ацини в железах в результате аутоиммунных или лучевой терапии непроходят самообновления, что приводит к тому, что пациент живет с необратимым повреждением 6. Изучение слюнных желез также привлекло внимание или исследователей, заинтересованных в механизмах вирусного патогенеза. Некоторые патогенные микроорганизмы, такие как цитомегаловирус человека (HCMV), постоянно размножаются в слюнных железах, что позволяет передавать зарождающийся вирус новому хозяину через слюну7,8. Таким образом, существует неудовлетворенная потребность в разработке надежных и воспроизводимых моделей in vitro ткани слюнных желез для решения и понимания широкого спектра медицинских проблем.
Несколько моделей системы слюнных желез мины были использованы в качестве отправной точки для понимания и характеристики различных эпителиальных клеток, которые образуют слюнные железы9,10. Существуют очевидные и основные различия между человеческими и муриновыми слюнными железами11. Наиболее примечательно человеческого околоушной железы больше по отношению к submandibular железы в то время как мышь submandibular и околоушной очень похожи по размеру1,2,11. Хотя увековеченные человеческие подмандибулярные клеточные линии существуют, есть серьезные опасения, что увековеченные клетки не точно поддерживают фенотип первичной ткани и вторичные опасения, что увековеченные клетки на самом деле не являются производными от слюнный эпителий сам12. По этим причинам существует интерес и необходимость изучения первичной слюнной ткани у человека.
Здесь мы описываем протокол для изоляции первичных эпителиальных клеток из слюнных желез человека для культуры тканей. Наш протокол основан на работах Pringle et al. и Tran et al. с изменениями, внесенными, чтобы в целом упростить их процедуры13,14. Во-первых, в то время как протокол Tran et al. требует длительной пятичасовой инкубации для ферментативного переваривания слюнной ткани, наш измененный протокол был успешным с всего лишь один час инкубации, аналогичной той, что в Pringle и др. Во-вторых, мы используем различные ферменты для пищеварения тканей, прежде всего мы не используем трипсин, как это используется в оригинальном протоколе Tran et al., но вместо этого используем смесь диспазы и коллагеназы. Мы предпочитаем, чтобы избежать трипсина в начальных шагов пищеварения, как недавнее исследование показало, что первоначальное пищеварение слюнной ткани трипсин приводит к снижению жизнеспособности клеток, возможно, в результате потери редкой популяции стволовых клеток15. Наконец, мы культуры салисферы на поверхности подвальной мембранной матрицы (БММ) с использованием коммерчески доступных средств массовой информации, первоначально разработанных для распространения бронхиальных эпителиальных клеток. Наш протокол может быть использован для изолировать слюнные клетки от околоушных, подчелюстных и сублингвальных желез. Эти клетки выражают слюнную амилазу и другие специфические гены слюны, указывающие на то, что ониподдерживают фенотип, похожий на слюнные асинарные эпителиальные клетки 7. Мы успешно создали слюнные культуры из основных образцов тканей человека с помощью этой методологии. Кроме того, первичные слюнные клетки могут быть легко криоконсервированы для использования на более поздний срок.
Protocol
Representative Results
Discussion
Слюнная дисфункция представляет собой заботу о качестве жизни для тех, кто страдает от синдрома Шегрена, а также тех, кто проходит лучевую терапию для рака, прилегающих к слюнных желез3,4,5, 16. Один из предлагаемых тера?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Джеймса. Бриджеса за предоставление значительных рекомендаций по методологиям, участвующим в культивирование первичных ячеек. Мэтью Дж.Биклер был поддержан Национальными институтами здравоохранения Обучение Грант T32-ES007250. Эта работа была также поддержана Национальными институтами здравоохранения грантов R01-AI121028 и R21-DE026267 присуждается Уильям У. Миллер.
Materials
| 100 mm culture dishes | Thermo Scientific | 172931 | |
| 15 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339653 | |
| Bronchial Epithelial Cell Growth Media | Lonza | CC-3171 | Add bullet kit as per manufacturer's instructions. Supplement with 20 mL of charcoal stripped serum. |
| Cell strainer 70 µm nylon mesh | Fisher | 22-363-548 | |
| Charcoal stripped fetal bovine serum | Gibco | 12676-029 | |
| Collagenase type III | Worthington | LS004182 | Store at 4 °C. |
| Cryogenic Tube | Fisher | 5000-0020 | |
| Dispase | Cell Applications | 07923 | Dissolve collagenase to make a 0.15% (w/v) stock. Filter sterilize then store at -20 °C. |
| Dissecting scissors | Fisher | 08-940 | |
| Dulbecco phosphate buffered saline | Corning | 55-031-PC | |
| General Chemicals | Sigma | ||
| PathClear Basement membrane extract | Cultrex | 3432-005-01 | Thaw at 4 °C at least 24 hr prior to use. Always handle on ice. |
| Six-well culture dishes | Falcon | 353046 | |
| Surgical forceps | Fisher | 22-079-742 | |
| Trypsin-EDTA solution | Corning | 25-052-CI |
References
- Kessler, A. T., Bhatt, A. A. Review of the Major and Minor Salivary Glands, Part 1: Anatomy, Infectious, and Inflammatory Processes. Journal of Clinical Imaging Science. 8, 47 (2018).
- Holmberg, K. V., Hoffman, M. P., Ligtenberg, A. J. M., Veerman, E. C. I. Anatomy, Biogenesis and Regeneration of Salivary Glands. Monographs in Oral Science. 24, 1-13 (2014).
- Vissink, A., et al. Prevention and Treatment of the Consequences of Head and Neck Radiotherapy. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14, 213-225 (2003).
- Gualtierotti, R., Marzano, A., Spadari, F., Cugno, M. Main Oral Manifestations in Immune-Mediated and Inflammatory Rheumatic Diseases. Journal of Clinical Medicine. 8, 21 (2018).
- Tsukamoto, M., Suzuki, K., Takeuchi, T. Ten-year observation of patients with primary Sjögren’s syndrome: Initial presenting characteristics and the associated outcomes. International Journal of Rheumatology. Dis. , (2018).
- Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: A literature review. Cancer. 107, 2525-2534 (2006).
- Morrison, K. M., et al. Development of a primary human cell model for the study of human cytomegalovirus replication and spread within salivary epithelium. Journal of Virology. , (2018).
- Pomeroy, C., Englund, J. A. Cytomegalovirus: epidemiology and infection control. American Journal of Infection Control. 15, 107-119 (1987).
- Maimets, M., et al. Long-Term In Vitro Expansion of Salivary Gland Stem Cells Driven by Wnt Signals. Stem Cell Reports. 6, 150-162 (2016).
- Varghese, J. J., et al. Salivary gland cell aggregates are derived from self-organization of acinar lineage cells. Archives of Oral Biology. 97, 122-130 (2019).
- Maruyama, C., Monroe, M., Hunt, J., Buchmann, L., Baker, O. Comparing human and mouse salivary glands: A practice guide for salivary researchers. Oral Diseases. , (2018).
- Lin, L. C., et al. Cross-contamination of the human salivary gland HSG cell line with HeLa cells: A STR analysis study. Oral Diseases. 24, 1477-1483 (2018).
- Tran, S. D., et al. Primary Culture of Polarized Human Salivary Epithelial Cells for Use in Developing an Artificial Salivary Gland. Tissue Engineering. 11, 172-181 (2005).
- Pringle, S., et al. Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
- Nam, H., et al. Characterization of Primary Epithelial Cells Derived from Human Salivary Gland Contributing to in vivo Formation of Acini-like Structures. Molecules and Cells. 41, 515-522 (2018).
- Vissink, A., Jansma, J., Spijkervet, F. K. L., Burlage, F. R., Coppes, R. P. Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14, 199-212 (2003).
- Cannon, M. J., et al. Repeated measures study of weekly and daily cytomegalovirus shedding patterns in saliva and urine of healthy cytomegalovirus-seropositive children. BMC Infect. Dis. 14, (2014).
- Pringle, S., et al. Human Salivary Gland Stem Cells Functionally Restore Radiation Damaged Salivary Glands: Hyposalivation Cell Therapy. STEM CELLS. 34, 640-652 (2016).
- Maria, O. M., Maria, O., Liu, Y., Komarova, S. V., Tran, S. D. Matrigel improves functional properties of human submandibular salivary gland cell line. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 43, 622-631 (2011).
- Srinivasan, P. P., et al. Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture: Differentiation of Salivary Stem/Progenitor Cells. STEM CELLS Translational Medicine. 6, 110-120 (2017).
- Foraida, Z. I., et al. Elastin-PLGA hybrid electrospun nanofiber scaffolds for salivary epithelial cell self-organization and polarization. Acta Biomaterialia. 62, 116-127 (2017).
