Salispheres veya Monolayers olarak In vitro büyüme için ınsan tükürük bezlerinden tükürük epitelyal hücrelerin yalıtım
Summary
Birincil insan tükürük bezi türevi epitelyal hücreleri izole etmek ve yetiştirmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu hücreler onları tükürük epitelyal orijinli olmak ile tutarlı gen ifade desenleri sergiler ve Engelbreth-Holm-Swarm tümör hücrelerinden türetilen Bodrum membran matrisleri üzerinde salispheres olarak veya tedavi kültür yemekleri monolayers olarak yetişebilir.
Abstract
Tükürük bezleri insan hastalığının birden fazla yönü ile ilgilenen araştırmacılar için önemli bir ilgi alanı vardır. Araştırmacıların bir amacı, Radyasyon terapileri veya Sjögren sendromu ile ilişkili patolojiler nedeniyle hasar görmüş bezlerin fonksiyonunu geri yüklemek. Araştırmacıların ikinci hedefi, virüslerin glandüler doku içinde çoğaldığı mekanizmaları tanımlamaktır, böylece yatay iletim için önemli olan tükürük sıvılarına erişim sağlayabilirler. Bu hedefler yukarıda bahsedilen yanı sıra ilgili araştırma alanları ile ilgilenen araştırmacılar tarafından kullanılabilecek sağlam ve erişilebilir bir in vitro tükürük bezi modeli için ihtiyaç vurgulayın. Burada, epitelyal hücreleri insan tükürük bezlerinden yalıtmak ve onları in vitro yaymak için basit bir protokol tartışıyoruz. Protokollerimiz, bireysel çalışmaların ihtiyaçlarını karşılamak için daha da optimize edilebilir. Kısaca, tükürük dokusu mekanik ve enzince tek hücreleri veya hücrelerin küçük kümeleri yalıtmak için ayrılır. Epitelyal hücreler için seçim, epitelyal hücre büyümesini teşvik etmek için optimize edilmiş medyanın varlığında bir Bodrum membran matrisinin üzerine kaplamadan oluşur. Bu ortaya çıkan kültürler üç boyutlu kümeleri olarak muhafaza edilebilir, “salispheres” olarak adlandırılan, ya da tedavi plastik doku kültürü yemekleri bir tek tabakalı olarak büyüdü. Bu protokol, hücresel senescence yapmadan önce 5-8 pasajlar (15-20 nüfus doublings) için yayılabilir ağırlıklı olarak epitelyal hücrelerin heterojen bir nüfusun gelişmesinde sonuçlanır.
Introduction
Memelilerde, tükürük bezleri 3 çift büyük tükürük bezi halinde düzenlenmiştir: parotis, submandibular ve dil altı bezleri. Ayrıca dilde bulunan ve ağız boşluğu boyunca dağınık küçük bezleri bir dizi var1. Büyük bezleri üretilen tükürük toplu hacminin sorumludur2. Salgılanmış faktörler aracılığıyla antimikrobiyal koruma sağlamaya ek olarak, tükürük, özofagus2‘ den geçerken gıda çiğneme ve yağlama sürecinde önemlidir. Bu nedenle, tükürük bezi disfonksiyon yeterli tükürük üretmek mümkün olmayan hastalarında diş boşlukları veya oral kandidiyasis3gibi maladies gelişmekte daha eğilimli olduğu bir tıbbi sorunu temsil eder. Ayrıca, düşük tükürük sonuçları yaşam kalitesi üzerinde önemli bir etkiye sahip yemek ve sindirme daha fazla zorluk.
Tükürük bezi disfonksiyon öncelikle Sjögren sendromu muzdarip hastalarda bulunur, otoimmün bozukluk, ya da ışınlama terapisi geçirmiş olan baş ve boyun kanseri olan hastalarda3,4,5, 6‘ ya kadar. Otoimmünite veya radyasyon tedavisinin bir sonucu olarak bezler içinde hasarlı salgını acini kendi kendine yenilenmez, bu da geri dönüşümsüz hasar6ile yaşayan bir hasta ile sonuçlanır. Tükürük bezleri çalışma da dikkat veya viral patogenezi mekanizmaları ile ilgilenen araştırmacılar topladı. İnsan sitomegalovirüs (HCMV) gibi bazı patojenler, daha sonra tükürük7,8üzerinden yeni bir ana bilgisayara doğmakta olan virüsü iletimi için izin veren tükürük bezleri içinde ısrarla çoğaltır. Böylece, çeşitli tıbbi sorunları çözmek ve anlamak için tükürük bezi dokusunun sağlam ve tekrarlanabilir in vitro modellerini geliştirmek için karşılanmamış bir ihtiyaç vardır.
Murine tükürük bezi sisteminin birkaç modeli, tükürük bezlerini oluşturacak farklı epitelyal hücreleri anlamak ve karakterize etmek için bir başlangıç noktası olarak kullanılmıştır9,10. İnsan ve murine tükürük bezleri arasında açık ve önemli farklar var11. Fare submandibular ve parotis boyutu1,2,11çok benzer iken en önemlisi insan parotis bezi submandibular bezi ile ilgili olarak daha büyük. Ölümsüzleştirilmiş insan submandibular hücre hatları var iken, ölümsüzleştirilmiş hücrelerin doğru birincil doku ve ikincil endişeleri fenotipi korumak değil büyük endişeleri vardır ölümsüzleştirilmiş hücreler aslında türetilmemiş tükürük epitelin kendisi12. Bu nedenlerle bir ilgi ve insanlardan birincil tükürük dokusu çalışması için bir ihtiyaç vardır.
Burada, primer epitelyal hücreleri doku kültürü için insan tükürük bezlerinden yalıtmak için bir protokol açıklanmaktadır. Protokollerimiz Pringle ve al. ve Tran ve Al ‘ın eserlerine dayanmaktadır. genellikle prosedürlerini kolaylaştırmak için yapılan değişikliklerle13,14. İlk olarak, Tran ve al. ‘ nin Protokolü, tükürük dokusunu enzikatik olarak sindirmek için uzun bir beş saatlik kuluçka çağrısı yaparken, modifiye protokolüm, Pringle ve Al ‘da benzer şekilde bir saatlik kuluçka gibi az başarılı olmuştur. İkinci olarak, doku sindirimi için farklı enzimler kullanıyoruz, özellikle de orijinal Tran ve el protokolünde kullanılan tripsin kullanmayın, ancak bunun yerine dispaz ve collagenase karışımı kullanın. Biz yeni bir çalışma olarak ilk sindirim adımlarında tripsin önlemek için tercih düşük hücre viability tripsin sonuçları tarafından tükürük dokusunun ilk sindirim, muhtemelen nadir bir kök hücre nüfus kaybı tarafından önerilen15. Son olarak, biz kültür Bodrum membran matris (BMM) yüzeyinde salispheres aslen bronş epitelyal hücrelerin yayılması için formüle ticari olarak kullanılabilen bir medya kullanarak. Protokollerimiz, parotis, submandibular ve altdilde bezlerden gelen tükürük hücrelerini izole etmek için kullanılabilir. Bu hücreler, tükürük asiner epitelyal hücrelerine benzer bir fenotip bulundurduğunu gösteren tükürük amilaz ve diğer tükürük spesifik genlerini ifade ederler7. Bu metodolojisi kullanarak > 50 primer insan dokusu örneklerinden tükürük kültürlerini başarıyla üretiyoruz. Dahası, birincil tükürük hücreleri kolayca daha sonraki bir tarihte kullanılmak üzere kriokonservirovannogo olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tükürük disfonksiyon, Sjögren sendromundan muzdarip olanlar için yaşam kalitesinin yanı sıra tükürük bezlerine bitişik kanserler için radyasyon terapisi3,4,5, 16 yaşında. Bu hastalar tedavi etmek için bir önerilen terapi fonksiyonel tükürük kök hücreleri veya organoids içinde vitro, daha sonra etkilenen doku9yerine hasarlı tükürük bezi içine …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz birincil hücreler kültür için yer metodolojileri önemli rehberlik sağlamak için James P. Bridges teşekkür etmek istiyoruz. Matthew J. Beucler sağlık eğitim hibe T32-ES007250 Ulusal Enstitüleri tarafından destekleniyordu. Bu çalışma Ayrıca Ulusal Sağlık Bursları R01-AI121028 ve R21-DE026267 tarafından William E. Miller ‘a verilir.
Materials
| 100 mm culture dishes | Thermo Scientific | 172931 | |
| 15 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339653 | |
| Bronchial Epithelial Cell Growth Media | Lonza | CC-3171 | Add bullet kit as per manufacturer's instructions. Supplement with 20 mL of charcoal stripped serum. |
| Cell strainer 70 µm nylon mesh | Fisher | 22-363-548 | |
| Charcoal stripped fetal bovine serum | Gibco | 12676-029 | |
| Collagenase type III | Worthington | LS004182 | Store at 4 °C. |
| Cryogenic Tube | Fisher | 5000-0020 | |
| Dispase | Cell Applications | 07923 | Dissolve collagenase to make a 0.15% (w/v) stock. Filter sterilize then store at -20 °C. |
| Dissecting scissors | Fisher | 08-940 | |
| Dulbecco phosphate buffered saline | Corning | 55-031-PC | |
| General Chemicals | Sigma | ||
| PathClear Basement membrane extract | Cultrex | 3432-005-01 | Thaw at 4 °C at least 24 hr prior to use. Always handle on ice. |
| Six-well culture dishes | Falcon | 353046 | |
| Surgical forceps | Fisher | 22-079-742 | |
| Trypsin-EDTA solution | Corning | 25-052-CI |
References
- Kessler, A. T., Bhatt, A. A. Review of the Major and Minor Salivary Glands, Part 1: Anatomy, Infectious, and Inflammatory Processes. Journal of Clinical Imaging Science. 8, 47 (2018).
- Holmberg, K. V., Hoffman, M. P., Ligtenberg, A. J. M., Veerman, E. C. I. Anatomy, Biogenesis and Regeneration of Salivary Glands. Monographs in Oral Science. 24, 1-13 (2014).
- Vissink, A., et al. Prevention and Treatment of the Consequences of Head and Neck Radiotherapy. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14, 213-225 (2003).
- Gualtierotti, R., Marzano, A., Spadari, F., Cugno, M. Main Oral Manifestations in Immune-Mediated and Inflammatory Rheumatic Diseases. Journal of Clinical Medicine. 8, 21 (2018).
- Tsukamoto, M., Suzuki, K., Takeuchi, T. Ten-year observation of patients with primary Sjögren’s syndrome: Initial presenting characteristics and the associated outcomes. International Journal of Rheumatology. Dis. , (2018).
- Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: A literature review. Cancer. 107, 2525-2534 (2006).
- Morrison, K. M., et al. Development of a primary human cell model for the study of human cytomegalovirus replication and spread within salivary epithelium. Journal of Virology. , (2018).
- Pomeroy, C., Englund, J. A. Cytomegalovirus: epidemiology and infection control. American Journal of Infection Control. 15, 107-119 (1987).
- Maimets, M., et al. Long-Term In Vitro Expansion of Salivary Gland Stem Cells Driven by Wnt Signals. Stem Cell Reports. 6, 150-162 (2016).
- Varghese, J. J., et al. Salivary gland cell aggregates are derived from self-organization of acinar lineage cells. Archives of Oral Biology. 97, 122-130 (2019).
- Maruyama, C., Monroe, M., Hunt, J., Buchmann, L., Baker, O. Comparing human and mouse salivary glands: A practice guide for salivary researchers. Oral Diseases. , (2018).
- Lin, L. C., et al. Cross-contamination of the human salivary gland HSG cell line with HeLa cells: A STR analysis study. Oral Diseases. 24, 1477-1483 (2018).
- Tran, S. D., et al. Primary Culture of Polarized Human Salivary Epithelial Cells for Use in Developing an Artificial Salivary Gland. Tissue Engineering. 11, 172-181 (2005).
- Pringle, S., et al. Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
- Nam, H., et al. Characterization of Primary Epithelial Cells Derived from Human Salivary Gland Contributing to in vivo Formation of Acini-like Structures. Molecules and Cells. 41, 515-522 (2018).
- Vissink, A., Jansma, J., Spijkervet, F. K. L., Burlage, F. R., Coppes, R. P. Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14, 199-212 (2003).
- Cannon, M. J., et al. Repeated measures study of weekly and daily cytomegalovirus shedding patterns in saliva and urine of healthy cytomegalovirus-seropositive children. BMC Infect. Dis. 14, (2014).
- Pringle, S., et al. Human Salivary Gland Stem Cells Functionally Restore Radiation Damaged Salivary Glands: Hyposalivation Cell Therapy. STEM CELLS. 34, 640-652 (2016).
- Maria, O. M., Maria, O., Liu, Y., Komarova, S. V., Tran, S. D. Matrigel improves functional properties of human submandibular salivary gland cell line. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 43, 622-631 (2011).
- Srinivasan, P. P., et al. Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture: Differentiation of Salivary Stem/Progenitor Cells. STEM CELLS Translational Medicine. 6, 110-120 (2017).
- Foraida, Z. I., et al. Elastin-PLGA hybrid electrospun nanofiber scaffolds for salivary epithelial cell self-organization and polarization. Acta Biomaterialia. 62, 116-127 (2017).
