Vi viser en metode for obduksjon og Disseksjon av mus prostata kreft modeller, med fokus på prostata svulst disseksjon. En steg-for-trinn protokoll for generering av mus prostata tumor organoids er også presentert.
Metoder basert på homologe rekombinasjon å modifisere gener har signifikant fremmet biologisk forskning. Genmodifiserte mus modeller (GEMMs) er en streng metode for å studere pattedyr utvikling og sykdom. Vårt laboratorium har utviklet flere GEMMs av prostatakreft (PCa) som mangler uttrykk for en eller flere tumor Suppressor gener ved hjelp av nettstedet-spesifikke grobunn-loxP recombinase system og en prostata-spesifikk promoter. I denne artikkelen beskriver vi vår metode for obduksjon av disse PCa GEMMs, primært med fokus på Disseksjon av mus prostata svulster. Nye metoder utviklet i løpet av det siste tiåret har muliggjort kulturen av epitel-avledet celler til modell organsystemer in vitro i tre dimensjoner. Vi har også detalj en 3D cellekultur metode for å generere tumor organoids fra musen PCa GEMMs. Pre-klinisk kreftforskning har vært dominert av 2D cellekultur og cellelinje-avledet eller pasient-avledet xenograft modeller. Disse metodene mangler tumor mikromiljøet, en begrensning av å bruke disse teknikkene i pre-kliniske studier. GEMMs er mer fysiologisk-relevant for å forstå tumorigenesis og kreft progresjon. Tumor organoid kultur er en in vitro modell system som viser tumor arkitektur og celle avstamning egenskaper. I tillegg 3D cellekultur metoder tillater vekst av normale celler for sammenligning til tumor cellekulturer, sjelden mulig å bruke 2D cellekultur teknikker. I kombinasjon, bruk av GEMMs og 3D cellekultur i pre-kliniske studier har potensial til å forbedre vår forståelse av kreft biologi.
Siden slutten av 1980-tallet, har evnen til å endre gener ved homologe rekombinasjon sterkt avanserte studiet av biologiske systemer1. Induserbart, vevs-, eller celle spesifikke Promotor systemer og områdespesifikke recombinases, slik som grobunn loxP, har avanserte genetiske studier ved å tilrettelegge kontroll over genetiske modifikasjoner både timelig og romlig2,3, firetil. Kombinasjonen av disse genetiske strategiene har skapt et bredt spekter av eksperimentelle modellsystemer5,6,7.
Genmodifiserte mus modeller (GEMMs) er et integrert verktøy for å vurdere hvordan enkelte gener eller grupper av gener påvirker pattedyr utvikling og sykdom. I pre-klinisk kreftforskning, GEMMs er den mest fysiologisk-relevant og streng metode for å studere kreftutvikling, progresjon, og behandling8. Vårt laboratorium har spesialisert seg på generering og karakteriserer av kreft GEMMs.
Den mest diagnostisert ikke-hud kreft blant menn i USA er prostatakreft (PCa). Flertallet av pasientene med PCa har lav risiko sykdom og høy sannsynlighet for overlevelse, men overlevelsesraten avtar drastisk når sykdommen diagnostiseres ved avanserte stadier, eller hvis målrettet hormonell behandling induserer progresjon til aggressiv, ikke-kureres PCa under typer9,10. Vårt laboratorium har utviklet GEMMs som utnytter floxed alleler av en eller flere tumor Suppressor gener. Rekombinasjon og tap av tumor Suppressor genuttrykk forekommer spesielt i prostata fordi vi har innført en transgene med grobunn recombinase nedstrøms av probasin arrangøren aktiveres bare i prostata epitelceller11, 12. we har også avlet vår GEMMs å inneholde en grobunn reporter transgene kalt mT/mG, som induserer tomat fluorescerende protein uttrykk i celler mangler grobunn og grønt fluorescerende protein (GFP) uttrykk i celler med grobunn13. Mens presentasjonen av denne metoden og våre representative resultater viser GEMMs vi studerer i laboratoriet vårt, kan denne protokollen brukes til å generere prostatakreft organoids fra alle musemodell. Men, som diskutert i detalj i våre representative resultater delen, har vi observert at visse tumor egenskaper er optimale for prostatakreft organoid generasjon.
I det siste tiåret har nye metoder for dyrking celler fra vev av epitel opprinnelse ført til betydelige fremskritt i vår evne til å modellere organsystemer i vitro14,15. Begrepet “3D cellekultur” har blitt tilskrevet teknikker involvert i etablering og vedlikehold organoids, som kan være generelt definert som strukturer består av celler som monterer sekundær arkitektur drevet av organ-spesifikk celle avstamning egenskaper16. Disse nye metodene er forskjellige fra klassisk 2D cellekultur i at cellene ikke krever transformasjon eller immortalization for langsiktig vekst; Dermed kan 3D-kulturer av normale celler sammenlignes med syke celler. Dette er spesielt verdifullt i kreftforskning hvor normal cellekontroll kulturer har vanligvis ikke vært tilgjengelig. I tillegg organoids spontant danne sekundære vev arkitekturer med riktig differensiert celletyper, noe som gjør dem til et bedre modell system for å forstå kreft in vitro enn 2D cellelinjer17. Vårt laboratorium har skapt 3D organoid linjer fra tumor problemet isolert fra vår PCa GEMMs å utfylle våre in vivo data og utføre eksperimenter som ikke ville være gjennomførbart i GEMMs.
I denne artikkelen presenterer vi skriftlige og visuelle protokoller for den komplette obduksjon av PCa GEMMs, inkludert Disseksjon av distinkte mus prostata fliker og metastatisk lesjoner. Vi beskriver og viser en trinnvis metode for å generere organoids fra mus prostata svulster basert på en protokoll tidligere utgitt av Drost et al. for avledet organoids fra normal mus prostata epitel vev18.
Kritiske skritt i protokollen for prostata tumor disseksjon og organoid generasjon
Fjerning av ikke-prostata vev og fine Disseksjon av musen prostata tumor er avgjørende for den optimale generasjonen av kreft organoids siden både ikke-prostata epitelceller og normal prostata epitelceller vil generere organoids. For solid prostata svulster spesielt, er det avgjørende å isolere områder av levedyktig svulst for å fjerne forurensning med nekrotisk vev som ville redusere antall levedyktige celler. Un…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne takke Calvin Kuo Laboratory ved Stanford University for å gi HEK293 celler stabilt transfekterte med enten HA-Mouse noggin-FC eller HA-Mouse Rspo1-FC. Vi vil også gjerne takke Dr. Dean tang for å la oss få tilgang til fluorescerende disseksjon mikroskop i laboratoriet hans. Dette arbeidet ble støttet av CA179907 til D.W.G. fra National Cancer Institute. Delte ressurser på Roswell Park Comprehensive Cancer Center ble støttet av National Institutes of Health Cancer Center support Grant CA016056.
0.25 % Trypsin+2.21 mM EDTA | Sigma | 25-053 | |
1 1/4 in, 23 gauge, disposable syringe needles | Becton Dickinson | Z192430 | |
10 % neutral buffered formalin | Sigma | HT501128 | |
32 % paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15714 | |
A83-01 | MedChemExpress | HY-10432 | |
Advanced DMEM/F12+++ | Gibco | 12634 | |
Analytical balance | Mettler Toledo | 30216623 | |
B27 (50X) | Gibco | 17504044 | |
Collagenase II | Gibco | 17101015 | |
Dissecting Board | Thermo-Fisher | 36-1 | |
EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10 | Manufactured by Trevigen | Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory | Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix |
HEPES (1M) | Sigma | 25-060 | |
human recombinant Epidermal growth factor (EGF) | PeproTech | AF-100-15 | |
L-glutamine (200 mM) | Sigma | 25-005 | |
N-Acetyl-L-Cysteine | Sigma | A9165 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
Precision balance | Mettler Toledo | 30216561 | |
Scalpel #23 | World Precision Instruments | 504176 | |
Scalpel Handle #7, 16 cm | World Precision Instruments | 500238 | |
Single-edge carbon razor blade | Fisherbrand | 12-640 | |
Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight | World Precision Instruments | 14393 | |
Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated | World Precision Instruments | 15915 | |
Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated | World Precision Instruments | 504489 | |
Y-276632 (Rock Inhibitor) | APExBIO | A3008 |