Поколение опухолевых органоидов из генетически модифицированных моделей мыши рака простаты

С конца 1980-х годов способность изменять гены с помощью гомологичных рекомбинаций значительно продвинула изучение биологических систем^1. Индуцированные, ткани- или клеточные промоторные системы и конкретные рекомбиназы, такие как Cre-loxP, продвинули генетические исследования, облегчая контроль над генетическими модификациями как в и временно, так и пространственно^{2,3, 4}. Сочетание этих генетических стратегий создало широкийспектр экспериментальных модельных систем 5,^6,7.

Генетически модифицированные модели мыши (GEMMs) являются неотъемлемым инструментом для оценки того, как отдельные гены или группы генов влияют на развитие млекопитающих и болезни. В доклинических исследований рака, GEMMs являются наиболее физиологически релевантных и строгий метод для изучения развития рака, прогрессирование, и лечение⁸. Наша лаборатория специализируется на генерации и характеристике гЕММ рака.

Наиболее диагностируется некочее рак среди мужчин в Соединенных Штатах является рак простаты (PCa). Большинство пациентов с PCa имеют низкий риск заболевания и высокую вероятность выживания, но выживаемость резко снижается, когда болезнь диагностируется на поздних стадиях или если целевая гормональная терапия вызывает прогрессирование к агрессивной, неизлечимой PCa подтипы^9,10. Наша лаборатория разработала GEMMs, которые используют флоксированные аллели одного или нескольких генов супрессоров опухолей. Рекомбинация и потеря экспрессии гена супрессора опухоли происходит именно в предстательной железе, потому что мы ввели трансген с рекомбиназой Cre вниз по течению пробосин промотор активирован только в эпителиальных клетках простаты^{11, 12}. Мы также разводили наши GEMMs содержать Cre репортер трансген называется mT/mG, который вызывает томатфлуалистое выражение белка в клетках, не хватает Cre и зеленый флуоресцентный белок (GFP) выражение в клетках с Cre¹³. В то время как презентация этого метода и наши репрезентативные результаты показывают, что GEMMs, которые мы изучаем в нашей лаборатории, этот протокол может быть использован для генерации органов рака простаты из любой модели мыши. Однако, как подробно обсуждается в нашем разделе репрезентативных результатов, мы заметили, что определенные характеристики опухоли являются оптимальными для генерации органов орака простаты.

В последнее десятилетие, новые методы культивирования клеток из тканей эпителиального происхождения привело к значительным достижениям в нашей способности моделировать системы органов в пробирке^14,15. Термин “культура 3D клеток” был отнесен к методам, участвующим в создании и поддержании органоидов, которые могут быть определены как структуры, состоящие из клеток, которые собирают вторичную архитектуру, движимую органно-специфической линией клеток характеристики¹⁶. Эти новые методы отличаются от классической 2D-клеточной культуры в том, что клетки не требуют трансформации или увековечения для долгосрочного роста; таким образом, 3D культуры нормальных клеток можно сравнить с больными клетками. Это особенно ценно в исследованиях рака, где нормальные культуры контроля клеток, как правило, не были доступны. Кроме того, органоиды спонтанно образуют вторичные архитектуры тканей с соответствующим дифференцированным типом клеток, что делает их лучшей модельной системой для понимания рака в пробирке, чем 2D-клеточные линии^17. Наша лаборатория создала 3D органоидные линии из опухолевого вопроса, изолированных от наших PCa GEMM, чтобы дополнить наши данные in vivo и проводить эксперименты, которые не были бы осуществимы в GEMMs.

В этой статье мы представляем письменные и визуальные протоколы для полной некропсии PCa GEMMs, включая вскрытие различных долей простаты мыши и метастатических поражений. Мы описываем и показываем пошаговой метод генерации органоидов из опухолей простаты мыши на основе протокола, ранее опубликованного Drost et al. для получения органоидов из нормальной эпителиальной ткани простаты мыши¹⁸.