Summary

جيل من الأعضاء الورم من نماذج الماوس المهندسة وراثيا من سرطان البروستاتا

Published: June 13, 2019
doi:

Summary

نعرض طريقة لتشريح وتشريح نماذج سرطان البروستاتا الماوس، مع التركيز على تشريح ورم البروستاتا. كما يتم تقديم بروتوكول خطوة بخطوة لتوليد الأعضاء ورم البروستاتا الماوس.

Abstract

وقد أدت الأساليب القائمة على إعادة التركيب المتجانس لتعديل الجينات إلى تعزيز البحوث البيولوجية إلى حد كبير. نماذج الماوس المهندسة وراثيا (GEMMs) هي طريقة صارمة لدراسة تطور الثدييات والمرض. وقد طور مختبرنا العديد من GEMMs من سرطان البروستاتا (PCa) التي تفتقر إلى التعبير عن واحد أو عدة جينات قمع الورم باستخدام موقع محدد Cre-loxP نظام إعادة الكومبوماومر والمروج البروستاتا محددة. في هذه المقالة، ونحن نصف طريقتنا لnecropsy من هذه GEMMs PCa، مع التركيز في المقام الأول على تشريح أورام البروستاتا الماوس. وقد سهلت الأساليب الجديدة التي تم تطويرها على مدى العقد الماضي ثقافة الخلايا المستمدة من الظهارة إلى نموذج أنظمة الأعضاء في المختبر في ثلاثة أبعاد. كما نقوم بتفصيل طريقة زراعة الخلايا ثلاثية الدنابية لتوليد أعضاء الورم من الماوس PCa GEMMs. وقد هيمنت أبحاث السرطان قبل السريرية من قبل ثقافة الخلايا 2D ونماذج xenograft المستمدة من خط الخلية أو المريض المستمدة. هذه الطرق تفتقر إلى البيئة الدقيقة الورم، والحد من استخدام هذه التقنيات في الدراسات ما قبل السريرية. GEMMs هي أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية لفهم الأورام وتطور السرطان. ثقافة الجهاز الورم هو نظام نموذج في المختبر الذي يلخص الهندسة المعمارية الورم وخصائص سلالة الخلية. وبالإضافة إلى ذلك، تسمح أساليب زراعة الخلايا ثلاثية الدمن بنمو الخلايا الطبيعية للمقارنة مع ثقافات الخلايا السرطانية، ونادراً ما يكون ذلك ممكناً باستخدام تقنيات زراعة الخلايا ثلاثية الد. في تركيبة، استخدام GEMMs وثقافة الخلايا ثلاثية الد في الدراسات ما قبل السريرية لديه القدرة على تحسين فهمنا لبيولوجيا السرطان.

Introduction

منذ أواخر الثمانينات، وقد تقدمت القدرة على تغيير الجينات عن طريق إعادة تركيب متجانسة إلى حد كبير دراسة النظم البيولوجية1. وقد تقدمت الدراسات الجينية من خلال تسهيل السيطرة على التعديلات الجينية من الناحيتين الزمنية والمكانية2و3، 4. وقد خلق الجمع بين هذه الاستراتيجيات الوراثيةمجموعة واسعة من أنظمة النماذج التجريبية 5،7.

نماذج الماوس المهندسة وراثيا (GEMMs) هي أداة متكاملة لتقييم كيفية تأثير الجينات الفردية أو مجموعات الجينات على نمو الثدييات والمرض. في أبحاث السرطان قبل السريرية، GEMMs هي الطريقة الأكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية وصارمة لدراسة تطور السرطان، والتقدم، والعلاج8. لدينا مختبر متخصص في توليد وتميز السرطان GEMMs.

السرطان غير الجلدي الأكثر تشخيصا ً بين الرجال في الولايات المتحدة هو سرطان البروستاتا (PCa). غالبية المرضى الذين يعانون من مرض PCa يعانون من مرض منخفض المخاطر واحتمال كبير للبقاء على قيد الحياة، ولكن معدلات البقاء على قيد الحياة تنخفض بشكل كبير عندما يتم تشخيص المرض في مراحل متقدمة أو إذا كان العلاج الهرموني المستهدف يحفز على التقدم إلى العدوانية، غير قابلة للشفاء PCa الأنواع الفرعية9،10. وقد وضعت مختبرنا GEMMs التي تستخدم الأليلات floxed من واحد أو أكثر من الجينات قمع الورم. إعادة تركيب وفقدان التعبير الجيني المثبط للورم يحدث على وجه التحديد في البروستاتا لأننا قد أدخلت transgene مع Cre recombinase المصب من المروج probasin تفعيلها فقط في الخلايا الظهارية البروستاتا11، 12.لقد ولدت أيضا لدينا GEMMs لاحتواء transgene مراسل كري دعا mT / mG، الذي يحفز الطماطم التعبير البروتين الفلورسنت في الخلايا التي تفتقر إلى Cre والأخضر بروتين الفلورسنت (GFP) التعبير في الخلايا مع كري13. في حين أن عرض هذه الطريقة ونتائجنا التمثيلية تظهر GEMMs ندرس في مختبرنا، يمكن استخدام هذا البروتوكول لتوليد الأعضاء سرطان البروستاتا من أي نموذج الماوس. ومع ذلك، كما نوقش بالتفصيل في قسم النتائج التمثيلية لدينا، لاحظنا أن بعض خصائص الورم هي الأمثل لتوليد سرطان البروستاتا العضوية.

في العقد الماضي ، أدت أساليب جديدة لزراعة الخلايا من الأنسجة ذات المنشأ الظهاري إلى تقدم كبير في قدرتنا على نموذج أنظمة الأعضاء في المختبر14،15. وقد عُزي مصطلح “ثقافة الخلايا ثلاثية الأبعاد” إلى التقنيات التي ينطوي عليها إنشاء الأعضاء وصيانتها، والتي يمكن تعريفها عموماً بأنها هياكل تتكون من خلايا تجمع الهندسة المعمارية الثانوية التي تحركها سلالة الخلايا الخاصة بالأعضاء. 16. هذه الأساليب الجديدة تختلف عن الكلاسيكية 2D ثقافة الخلية في أن الخلايا لا تتطلب التحول أو الخلود للنمو على المدى الطويل. وهكذا، يمكن مقارنة الثقافات 3D من الخلايا الطبيعية إلى الخلايا المريضة. وهذا أمر ذو قيمة خاصة في أبحاث السرطان حيث الثقافات العادية للسيطرة على الخلايا عادة لم تكن متاحة. وبالإضافة إلى ذلك، تشكل الأعضاء تلقائيا الأنسجة الثانوية مع أنواع الخلايا المتمايزة بشكل مناسب، مما يجعلها أفضل نظام نموذج لفهم السرطان في المختبر من خطوط الخلايا 2D17. وقد أنشأ مختبرنا خطوط عضوية ثلاثية الدنابية من قضية الورم معزولة عن نظام PCa GEMMs لدينا لاستكمال بياناتنا في الجسم الحي وإجراء التجارب التي لن تكون مجدية في GEMMs.

في هذه المقالة، نقدم بروتوكولات مكتوبة ومرئية للنخر الكامل من GEMMs PCa، بما في ذلك تشريح فصوص البروستاتا الماوس متميزة والآفات النقيلية. نحن نصف ونظهر طريقة خطوة بخطوة لتوليد الأوجانات من أورام البروستاتا الماوس على أساس بروتوكول نشر سابقا من قبل Drost وآخرون لاشتقاق اتوجينيات من الأنسجة الظهارية البروستاتا الماوس العادي18.

Protocol

تم تنفيذ الإجراءات الحيوانية الموصوفة هنا بموافقة اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) في قسم الموارد الحيوانية المختبرية، مركز روزويل بارك الشامل للسرطان، بوفالو، نيويورك. ملاحظة: الفئران الذكور التي سيتم تشريحها لعزل البروستاتا أو أورام البروستا?…

Representative Results

تظهر في الشكل 2Aصور المحاصيل التمثيلية للفأر مع ورم البروستاتا الأولي الكبير المملوء بالسوائل في منطقة البروستاتا الأمامية . وعلى النقيض من ذلك، يظهر الشكل 2B، صور ًا تمثيلية للفأر مع ورم كبير قوي في البروستاتا لا يمكن تمييزه من مناطق البر…

Discussion

الخطوات الحاسمة ضمن بروتوكول تشريح أورام البروستاتا وتوليد الجهازية
إزالة الأنسجة غير البروستاتا وتشريح غرامة من ورم البروستاتا الماوس أمر بالغ الأهمية للجيل الأمثل من الأعضاء السرطان ية منذ كل من الخلايا الظهارية غير البروستاتا والخلايا الظهارية البروستاتا الطبيعية سوف تو…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يود المؤلفون أن يشكروا مختبر كالفين كو في جامعة ستانفورد على توفير خلايا HEK293 التي تم نقلها بشكل لا يُنقل بعد ة إما مع HA-mouse Noggin-Fc أو HA-mouse Rspo1-Fc. كما نود أن نشكر الدكتور دين تانغ على السماح لنا بالوصول إلى مجهر تشريح الفلورسنت في مختبره. وقد تم دعم هذا العمل من قبل CA179907 إلى D.W.G. من المعهد الوطني للسرطان. تم دعم الموارد المشتركة في مركز روزويل بارك الشامل للسرطان من قبل المعاهد الوطنية لدعم مركز السرطان الصحي CA016056.

Materials

0.25 % Trypsin+2.21 mM EDTA Sigma 25-053
1 1/4 in, 23 gauge, disposable syringe needles Becton Dickinson Z192430
10 % neutral buffered formalin Sigma HT501128
32 % paraformaldehyde Electron Microscopy Services 15714
A83-01 MedChemExpress HY-10432
Advanced DMEM/F12+++ Gibco 12634
Analytical balance Mettler Toledo 30216623
B27 (50X) Gibco 17504044
Collagenase II Gibco 17101015
Dissecting Board Thermo-Fisher 36-1
EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10 Manufactured by Trevigen Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix
HEPES (1M) Sigma 25-060
human recombinant Epidermal growth factor (EGF) PeproTech AF-100-15
L-glutamine (200 mM) Sigma 25-005
N-Acetyl-L-Cysteine Sigma A9165
Penicillin-Streptomycin Sigma P4333
Precision balance Mettler Toledo 30216561
Scalpel #23 World Precision Instruments 504176
Scalpel Handle #7, 16 cm World Precision Instruments 500238
Single-edge carbon razor blade Fisherbrand 12-640
Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight World Precision Instruments 14393
Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated World Precision Instruments 15915
Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated World Precision Instruments 504489
Y-276632 (Rock Inhibitor) APExBIO A3008

References

  1. Capecchi, M. R. Altering the genome by homologous recombination. Science. 244 (4910), 1288-1292 (1989).
  2. Furth, P. A., et al. Temporal control of gene expression in transgenic mice by a tetracycline-responsive promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (20), 9302-9306 (1994).
  3. Aranda, M., et al. Altered directionality in the Cre-LoxP site-specific recombination pathway. Journal of Molecular Biology. 311 (3), 453-459 (2001).
  4. Schwenk, F., Kuhn, R., Angrand, P. O., Rajewsky, K., Stewart, A. F. Temporally and spatially regulated somatic mutagenesis in mice. Nucleic Acids Research. 26 (6), 1427-1432 (1998).
  5. Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).
  6. Goodrich, M. M., Talhouk, R., Zhang, X., Goodrich, D. W. An approach for controlling the timing and order of engineered mutations in mice. Genesis. 56 (8), 23242 (2018).
  7. Brocard, J., et al. Spatio-temporally controlled site-specific somatic mutagenesis in the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14559-14563 (1997).
  8. Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges. Cell. 163 (1), 39-53 (2015).
  9. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA: A Cancer Journal for Clinicians. , (2019).
  10. Bluemn, E. G., et al. Androgen Receptor Pathway-Independent Prostate Cancer Is Sustained through FGF Signaling. Cancer Cell. 32 (4), 474-489 (2017).
  11. Zhou, Z., et al. Synergy of p53 and Rb deficiency in a conditional mouse model for metastatic prostate cancer. Cancer Research. 66 (16), 7889-7898 (2006).
  12. Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
  13. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  14. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  15. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  16. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  17. Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
  18. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
  19. Oliveira, D. S., et al. The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline. Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).
  20. Callis, G., Sterchi, D. Decalcification of Bone: Literature Review and Practical Study of Various Decalcifying Agents, Methods, and Their Effects on Bone Histology. The Journal of Histotechnology. (21), 49-58 (1998).
  21. Dardenne, E., et al. N-Myc Induces an EZH2-Mediated Transcriptional Program Driving Neuroendocrine Prostate Cancer. Cancer Cell. 30 (4), 563-577 (2016).
  22. Blattner, M., et al. SPOP Mutation Drives Prostate Tumorigenesis In Vivo through Coordinate Regulation of PI3K/mTOR and AR Signaling. Cancer Cell. 31 (3), 436-451 (2017).
  23. Agarwal, S., et al. Identification of Different Classes of Luminal Progenitor Cells within Prostate Tumors. Cell Reports. 13 (10), 2147-2158 (2015).

Play Video

Cite This Article
Wadosky, K. M., Wang, Y., Zhang, X., Goodrich, D. W. Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer. J. Vis. Exp. (148), e59710, doi:10.3791/59710 (2019).

View Video