Generierung von Tumororganoiden aus gentechnisch veränderten Mausmodellen von Prostatakrebs

Seit den späten 1980er Jahren hat die Fähigkeit, Gene durch homologe Rekombination zu verändern, die Untersuchung biologischer Systeme stark vorangebracht¹. Induzible, gewebe- oder zellspezifische promotorische Systeme und standortspezifische Rekombinatore wie Cre-loxP haben fortgeschrittene genetische Studien, indem sie die Kontrolle über genetische Veränderungen sowohl zeitlich als auch räumlich erleichtern^{2,3, 4}. Die Kombination dieser genetischen Strategien hat eine breite Palette von experimentellen Modellsystemen^5,6,7geschaffen.

Gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEMMs) sind ein integrales Werkzeug, um zu beurteilen, wie einzelne Gene oder Gengruppen die Entwicklung und Krankheit von Säugetieren beeinflussen. In der präklinischen Krebsforschung sind GEMMs die physiologisch relevanteste und strengste Methode zur Untersuchung der Krebsentwicklung, Progression und Behandlung⁸. Unser Labor ist spezialisiert auf die Erzeugung und Charakterisierung von Krebs-GEMMs.

Der am häufigsten diagnostizierte nicht-kutane Krebs bei Männern in den Vereinigten Staaten ist Prostatakrebs (PCa). Die Mehrheit der Patienten mit PCa haben eine Erkrankung mit geringem Risiko und eine hohe Überlebenswahrscheinlichkeit, aber die Überlebensraten sinken drastisch, wenn die Krankheit im fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert wird oder wenn eine gezielte Hormontherapie das Fortschreiten zu einer aggressiven, nicht heilbaren PCa induziert. Subtypen^9,10. Unser Labor hat GEMMs entwickelt, die Flockenallele eines oder mehrerer Tumorsuppressorgene verwenden. Rekombination und Verlust der Tumorsuppressor-Genexpression tritt speziell in der Prostata auf, da wir ein Transgen mit Cre-Rekombinantase flussabwärts des Probasinpromotors eingeführt haben, der nur in den Prostataepithelzellen aktiviert ist^{11, 12}. Wir haben auch unsere GEMMs gezüchtet, um ein Cre-Reporter-Transgen namens mT/mG zu enthalten, das eine tomatenfluoreszierende Proteinexpression in Zellen ohne Cre- und grüne fluoreszierende Protein-Expression (GFP) in Zellen mit Cre¹³induziert. Während die Präsentation dieser Methode und unsere repräsentativen Ergebnisse GEMMs zeigen, die wir in unserem Labor untersuchen, kann dieses Protokoll verwendet werden, um Prostatakrebs-Organoide aus jedem Mausmodell zu erzeugen. Jedoch, wie im Detail in unserem repräsentativen Ergebnisabschnitt diskutiert, haben wir beobachtet, dass bestimmte Tumoreigenschaften für die Erzeugung von Prostatakrebs-Organoid optimal sind.

In den letzten zehn Jahren haben neue Methoden zur Kultivierung von Zellen aus Geweben epithelialen Ursprungs zu signifikanten Fortschritten in unserer Fähigkeit geführt, Organsysteme in vitro^14,15zu modellieren. Der Begriff “3D-Zellkultur” wurde den Techniken bei der Herstellung und Aufrechterhaltung von Organoiden zugeschrieben, die im Allgemeinen als Strukturen definiert werden können, die aus Zellen bestehen, die sekundäre Architektur zusammenfügen, die durch organspezifische Zelllinien angetrieben wird. Merkmale¹⁶. Diese neuen Methoden unterscheiden sich von der klassischen 2D-Zellkultur dadurch, dass Zellen keine Transformation oder Verewigung für langfristiges Wachstum erfordern; So können 3D-Kulturen normaler Zellen mit erkrankten Zellen verglichen werden. Dies ist besonders wertvoll in der Krebsforschung, wo normale Zellkontrollkulturen in der Regel nicht verfügbar waren. Darüber hinaus bilden Organoide spontan sekundäre Gewebearchitekturen mit entsprechend differenzierten Zelltypen, was sie zu einem besseren Modellsystem macht, um Krebs in vitro zu verstehen als 2D-Zelllinien¹⁷. Unser Labor hat 3D-Organoidlinien aus Tumorproblem erstellt, die aus unseren PCa GEMMs isoliert wurden, um unsere In-vivo-Daten zu ergänzen und Experimente durchzuführen, die bei GEMMs nicht möglich wären.

In diesem Artikel stellen wir schriftliche und visuelle Protokolle für die komplette Nekropsie von PCa GEMMs vor, einschließlich der Zerlegung von verschiedenen Mausprostatalappen und metastasierenden Läsionen. Wir beschreiben und zeigen eine Schritt-für-Schritt-Methode zur Erzeugung von Organoiden aus Maus-Prostatatumoren auf der Grundlage eines Protokolls, das zuvor von Drost et al. veröffentlicht wurde, um Organoide aus normalem Maus-Prostatagewebe abzuleiten¹⁸.