Geração de organóides tumorais de modelos de camundongo geneticamente modificados de câncer de próstata

Desde o final da década de 1980, a capacidade de alterar genes por recombinação homóloga tem avançado muito o estudo dos sistemas biológicos¹. Os sistemas inducible, tissue-, ou Cell-specific do promotor e recombinases local-específicos, tais como CRE-loxp, têm estudos genéticos avançados facilitando o controle sobre modificações genéticas ambos temporally e espacialmente^2,3, a ⁴. A combinação dessas estratégias genéticas criou uma ampla gama de sistemas experimentais de modelos^5,6,7.

Modelos de mouse geneticamente modificados (GEMMs) são uma ferramenta integral para avaliar como genes individuais ou grupos de genes afetam o desenvolvimento de mamíferos e doenças. Na pesquisa pré-clínica de câncer, os GEMMs são o método mais rigoroso e fisiologicamente relevante para estudar o desenvolvimento, progressão e tratamento do câncer⁸. Nosso laboratório especializa-se em gerar e caracterizar GEMMs do cancro.

O câncer não-cutâneo mais altamente diagnosticado entre os homens nos Estados Unidos é o câncer de próstata (PCa). A maioria dos pacientes com PCa tem doença de baixo risco e alta probabilidade de sobrevida, mas as taxas de sobrevida diminuem drasticamente quando a doença é diagnosticada em estágios avançados ou se a terapia hormonal direcionada induz progressão a PCa agressivo, não curável subtipos^9,10. Nosso laboratório desenvolveu GEMMs que utilizam alelos floxed de um ou mais genes supressores de tumor. Recombinação e perda da expressão gênica do supressor tumoral ocorre especificamente na próstata porque introduzimos um transgene com CRE recombinase downstream do promotor probasin ativado apenas em células epiteliais da próstata^{11, 12}. We igualmente criaram nossos gemms para conter um transgene do repórter de CRE chamado MT/mg, que induz a expressão fluorescente da proteína do tomate nas pilhas que faltam CRE e a expressão fluorescente verde da proteína (GFP) nas pilhas com CRE¹³. Enquanto a apresentação deste método e nossos resultados representativos mostram GEMMs que estudamos em nosso laboratório, este protocolo pode ser usado para gerar organóides de câncer de próstata a partir de qualquer modelo de mouse. Entretanto, como discutido em detalhe em nossa seção representativa dos resultados, nós observamos que determinadas características do tumor são ideais para a geração do organoid do cancro de próstata.

Na última década, novos métodos de cultivo de células de tecidos de origem epitelial levaram a avanços significativos em nossa capacidade de modelar sistemas de órgãos in vitro^14,15. O termo “cultura de células 3D” tem sido atribuído às técnicas envolvidas no estabelecimento e manutenção de organóides, que podem ser geralmente definidos como estruturas feitas de células que montam a arquitetura secundária impulsionada por linhagem de células específicas de órgãos características¹⁶. Estes novos métodos são distintos da cultura de células 2D clássicas em que as pilhas não necessitam de transformação ou imortalização para o crescimento a longo prazo; assim, as culturas 3D de pilhas normais podem ser comparadas às pilhas doentes. Isto é particularmente valioso na pesquisa do cancro onde as culturas normais do controle de pilha não estiveram tipicamente disponíveis. Além disso, organóides espontaneamente formam arquiteturas secundárias de tecidos com tipos de células adequadamente diferenciados, tornando-os um sistema de melhor modelo para entender o câncer in vitro do que as linhas de células 2D¹⁷. Nosso laboratório criou linhas organóides 3D da questão tumoral isolada de nossos PCa GEMMs para complementar nossos dados in vivo e realizar experimentos que não seriam viáveis em GEMMs.

Neste artigo, nós apresentamos protocolos escritos e visuais para o necropsia completo de gemms do PCA, incluindo a dissecção de lóbulos distintos da próstata do rato e de Lesões metastáticas. Nós descrevemos e mostramos um método passo a passo para gerar organóides dos tumores da próstata do rato baseados em um protocolo publicado previamente por Drost et al. para derivar organóides do tecido epithelial da próstata do rato normal¹⁸.