Summary

Geração de organóides tumorais de modelos de camundongo geneticamente modificados de câncer de próstata

Published: June 13, 2019
doi:

Summary

Nós mostramos um método para a necropsia e a dissecção de modelos do cancro da próstata do rato, focalizando na dissecção do tumor da próstata. Um protocolo passo a passo para a geração de organóides do tumor da próstata do rato é apresentado igualmente.

Abstract

Métodos baseados em recombinação homóloga para modificar genes têm promovido significativamente a pesquisa biológica. Modelos de rato geneticamente modificados (GEMMs) são um método rigoroso para estudar o desenvolvimento de mamíferos e doenças. Nosso laboratório desenvolveu vários GEMMs de câncer de próstata (PCa) que não possuem expressão de um ou vários genes supressores de tumor usando o sistema de recombinase CRE-loxP específico do site e um promotor específico da próstata. Neste artigo, nós descrevemos nosso método para o necropsia destes gemms do PCA, focalizando primeiramente na dissecção de tumores da próstata do rato. Novos métodos desenvolvidos ao longo da última década facilitaram a cultura de células derivadas de epitelial para modelar sistemas de órgãos in vitro em três dimensões. Nós igualmente detalham um método da cultura da pilha 3D para gerar organóides do tumor dos gemms do PCA do rato. A pesquisa de câncer pré-clínico tem sido dominada pela cultura de células 2D e por modelos de xenoenxertos derivados de células derivadas ou derivadas de pacientes. Estes métodos não têm microambiente tumoral, uma limitação do uso dessas técnicas em estudos pré-clínicos. Os GEMMs são mais fisiologicamente relevantes para a compreensão da tumorigênese e progressão do câncer. A cultura organóide tumoral é um sistema modelo in vitro que recapitula a arquitetura tumoral e as características da linhagem celular. Além, os métodos da cultura da pilha 3D permitem o crescimento de pilhas normais para a comparação às culturas da pilha do tumor, raramente possível usando técnicas da cultura da pilha 2D. Em combinação, o uso de GEMMs e cultura de células 3D em estudos pré-clínicos tem o potencial de melhorar a nossa compreensão da biologia do câncer.

Introduction

Desde o final da década de 1980, a capacidade de alterar genes por recombinação homóloga tem avançado muito o estudo dos sistemas biológicos1. Os sistemas inducible, tissue-, ou Cell-specific do promotor e recombinases local-específicos, tais como CRE-loxp, têm estudos genéticos avançados facilitando o controle sobre modificações genéticas ambos temporally e espacialmente2,3, a 4. A combinação dessas estratégias genéticas criou uma ampla gama de sistemas experimentais de modelos5,6,7.

Modelos de mouse geneticamente modificados (GEMMs) são uma ferramenta integral para avaliar como genes individuais ou grupos de genes afetam o desenvolvimento de mamíferos e doenças. Na pesquisa pré-clínica de câncer, os GEMMs são o método mais rigoroso e fisiologicamente relevante para estudar o desenvolvimento, progressão e tratamento do câncer8. Nosso laboratório especializa-se em gerar e caracterizar GEMMs do cancro.

O câncer não-cutâneo mais altamente diagnosticado entre os homens nos Estados Unidos é o câncer de próstata (PCa). A maioria dos pacientes com PCa tem doença de baixo risco e alta probabilidade de sobrevida, mas as taxas de sobrevida diminuem drasticamente quando a doença é diagnosticada em estágios avançados ou se a terapia hormonal direcionada induz progressão a PCa agressivo, não curável subtipos9,10. Nosso laboratório desenvolveu GEMMs que utilizam alelos floxed de um ou mais genes supressores de tumor. Recombinação e perda da expressão gênica do supressor tumoral ocorre especificamente na próstata porque introduzimos um transgene com CRE recombinase downstream do promotor probasin ativado apenas em células epiteliais da próstata11, 12. We igualmente criaram nossos gemms para conter um transgene do repórter de CRE chamado MT/mg, que induz a expressão fluorescente da proteína do tomate nas pilhas que faltam CRE e a expressão fluorescente verde da proteína (GFP) nas pilhas com CRE13. Enquanto a apresentação deste método e nossos resultados representativos mostram GEMMs que estudamos em nosso laboratório, este protocolo pode ser usado para gerar organóides de câncer de próstata a partir de qualquer modelo de mouse. Entretanto, como discutido em detalhe em nossa seção representativa dos resultados, nós observamos que determinadas características do tumor são ideais para a geração do organoid do cancro de próstata.

Na última década, novos métodos de cultivo de células de tecidos de origem epitelial levaram a avanços significativos em nossa capacidade de modelar sistemas de órgãos in vitro14,15. O termo “cultura de células 3D” tem sido atribuído às técnicas envolvidas no estabelecimento e manutenção de organóides, que podem ser geralmente definidos como estruturas feitas de células que montam a arquitetura secundária impulsionada por linhagem de células específicas de órgãos características16. Estes novos métodos são distintos da cultura de células 2D clássicas em que as pilhas não necessitam de transformação ou imortalização para o crescimento a longo prazo; assim, as culturas 3D de pilhas normais podem ser comparadas às pilhas doentes. Isto é particularmente valioso na pesquisa do cancro onde as culturas normais do controle de pilha não estiveram tipicamente disponíveis. Além disso, organóides espontaneamente formam arquiteturas secundárias de tecidos com tipos de células adequadamente diferenciados, tornando-os um sistema de melhor modelo para entender o câncer in vitro do que as linhas de células 2D17. Nosso laboratório criou linhas organóides 3D da questão tumoral isolada de nossos PCa GEMMs para complementar nossos dados in vivo e realizar experimentos que não seriam viáveis em GEMMs.

Neste artigo, nós apresentamos protocolos escritos e visuais para o necropsia completo de gemms do PCA, incluindo a dissecção de lóbulos distintos da próstata do rato e de Lesões metastáticas. Nós descrevemos e mostramos um método passo a passo para gerar organóides dos tumores da próstata do rato baseados em um protocolo publicado previamente por Drost et al. para derivar organóides do tecido epithelial da próstata do rato normal18.

Protocol

Os procedimentos animais aqui descritos foram realizados com a aprovação do Comitê institucional de cuidado e uso de animais (IACUC) no departamento de recursos de animais de laboratório, centro de câncer abrangente do Parque Roswell, Buffalo, Nova York. Nota: Camundongos machos a serem dissecados para isolar proestados ou tumores de próstata para a geração de organóides devem ter pelo menos atingido a idade da maturidade sexual — cerca de 8-10 semanas de idade. Ida…

Representative Results

As imagens representativas do necropsia de um rato com um grande tumor preliminar líquido-enchido da próstata na região anterior da próstata são mostradas na Figura 2a. Ao contrário, Figura 2B, mostra imagens representativas do necropsia de um rato com um grande tumor preliminar contínuo da próstata para que as regiões individuais da próstata sejam indistinguíveis. As imagens de dissecção fluorescente mostram o mesm…

Discussion

Etapas críticas dentro do protocolo para a dissecção do tumor da próstata e a geração organoid
A remoção do tecido da não-próstata e a dissecção fina do tumor da próstata do rato são cruciais para a geração óptima de organóides do cancro desde que as pilhas epithelial da não-próstata e as pilhas epithelial normais da próstata gerarão organóides. Para tumores de próstata sólidos especificamente, é crucial isolar áreas de tumor viável para remover a contaminação com tecido …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostariam de agradecer ao laboratório Calvin Kuo na Universidade de Stanford por fornecer HEK293 células estavelmente transfected com ou HA-mouse Noggin-FC ou HA-mouse Rspo1-FC. Também gostaríamos de agradecer ao Dr. Dean Tang por nos permitir acessar o microscópio de dissecção fluorescente em seu laboratório. Este trabalho foi apoiado por CA179907 a D.W.G. do Instituto Nacional do cancro. Os recursos compartilhados no centro de câncer abrangente do Roswell Park foram apoiados pelo centro de apoio ao câncer do National Institutes of Health CA016056.

Materials

0.25 % Trypsin+2.21 mM EDTA Sigma 25-053
1 1/4 in, 23 gauge, disposable syringe needles Becton Dickinson Z192430
10 % neutral buffered formalin Sigma HT501128
32 % paraformaldehyde Electron Microscopy Services 15714
A83-01 MedChemExpress HY-10432
Advanced DMEM/F12+++ Gibco 12634
Analytical balance Mettler Toledo 30216623
B27 (50X) Gibco 17504044
Collagenase II Gibco 17101015
Dissecting Board Thermo-Fisher 36-1
EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10 Manufactured by Trevigen Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix
HEPES (1M) Sigma 25-060
human recombinant Epidermal growth factor (EGF) PeproTech AF-100-15
L-glutamine (200 mM) Sigma 25-005
N-Acetyl-L-Cysteine Sigma A9165
Penicillin-Streptomycin Sigma P4333
Precision balance Mettler Toledo 30216561
Scalpel #23 World Precision Instruments 504176
Scalpel Handle #7, 16 cm World Precision Instruments 500238
Single-edge carbon razor blade Fisherbrand 12-640
Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight World Precision Instruments 14393
Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated World Precision Instruments 15915
Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated World Precision Instruments 504489
Y-276632 (Rock Inhibitor) APExBIO A3008

References

  1. Capecchi, M. R. Altering the genome by homologous recombination. Science. 244 (4910), 1288-1292 (1989).
  2. Furth, P. A., et al. Temporal control of gene expression in transgenic mice by a tetracycline-responsive promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (20), 9302-9306 (1994).
  3. Aranda, M., et al. Altered directionality in the Cre-LoxP site-specific recombination pathway. Journal of Molecular Biology. 311 (3), 453-459 (2001).
  4. Schwenk, F., Kuhn, R., Angrand, P. O., Rajewsky, K., Stewart, A. F. Temporally and spatially regulated somatic mutagenesis in mice. Nucleic Acids Research. 26 (6), 1427-1432 (1998).
  5. Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).
  6. Goodrich, M. M., Talhouk, R., Zhang, X., Goodrich, D. W. An approach for controlling the timing and order of engineered mutations in mice. Genesis. 56 (8), 23242 (2018).
  7. Brocard, J., et al. Spatio-temporally controlled site-specific somatic mutagenesis in the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14559-14563 (1997).
  8. Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges. Cell. 163 (1), 39-53 (2015).
  9. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA: A Cancer Journal for Clinicians. , (2019).
  10. Bluemn, E. G., et al. Androgen Receptor Pathway-Independent Prostate Cancer Is Sustained through FGF Signaling. Cancer Cell. 32 (4), 474-489 (2017).
  11. Zhou, Z., et al. Synergy of p53 and Rb deficiency in a conditional mouse model for metastatic prostate cancer. Cancer Research. 66 (16), 7889-7898 (2006).
  12. Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
  13. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  14. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  15. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  16. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  17. Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
  18. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
  19. Oliveira, D. S., et al. The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline. Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).
  20. Callis, G., Sterchi, D. Decalcification of Bone: Literature Review and Practical Study of Various Decalcifying Agents, Methods, and Their Effects on Bone Histology. The Journal of Histotechnology. (21), 49-58 (1998).
  21. Dardenne, E., et al. N-Myc Induces an EZH2-Mediated Transcriptional Program Driving Neuroendocrine Prostate Cancer. Cancer Cell. 30 (4), 563-577 (2016).
  22. Blattner, M., et al. SPOP Mutation Drives Prostate Tumorigenesis In Vivo through Coordinate Regulation of PI3K/mTOR and AR Signaling. Cancer Cell. 31 (3), 436-451 (2017).
  23. Agarwal, S., et al. Identification of Different Classes of Luminal Progenitor Cells within Prostate Tumors. Cell Reports. 13 (10), 2147-2158 (2015).

Play Video

Cite This Article
Wadosky, K. M., Wang, Y., Zhang, X., Goodrich, D. W. Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer. J. Vis. Exp. (148), e59710, doi:10.3791/59710 (2019).

View Video