Summary

הדור של אורגנואידים גידול מ מהונדסים גנטית עכבר מודלים של סרטן הערמונית

Published: June 13, 2019
doi:

Summary

אנו מראים שיטה של נקרופסי וניתוח של מודלים של סרטן הערמונית העכבר, התמקדות בניתוח גידול בערמונית. פרוטוקול צעד אחר צעד עבור דור של גידול בבלוטת הערמונית העכבר מוצג גם.

Abstract

שיטות המבוססות על הומוולוגי מחדש לשנות גנים יש לקידום משמעותי מחקר ביולוגי. מודלים של עכברים מהונדסים גנטית (GEMMs) הם שיטה קפדנית לחקר התפתחות היונקים והמחלות. המעבדה שלנו פיתחה מספר GEMMs של סרטן הערמונית (PCa) כי חוסר הבעה של אחד או מספר גנים מדכא הגידול באמצעות אתר ספציפי-loxP recombinase מערכת ומקדם הערמונית ספציפי. במאמר זה, אנו מתארים את השיטה שלנו נקרופסי של אלה PCa GEMMs, בעיקר התמקדות בניתוח של גידולים בערמונית העכבר. שיטות חדשות שפותחו במהלך העשור האחרון הקלו את התרבות של תאים האפיתל-הנגזרים למודל מערכות איברים בתחום החוץ בשלושה מימדים. כמו כן, אנו מפרטים שיטת התרבות התא 3D כדי לייצר אורגנואידים הגידול של העכבר PCa GEMMs. טרום קלינית מחקר הסרטן נשלט על ידי תרבות התא 2d ו קו הנגזר או החולה מודלים מבע. שיטות אלה חסרות מיקרואקולוגיה הגידול, מגבלה של שימוש בטכניקות אלה במחקרים קדם-קליניים. GEMMs הם יותר מבחינה פיזיולוגית-רלוונטי להבנת tuמוריגנזה התקדמות הסרטן. התרבות האורגאידית של הגידול היא מערכת מודל מבחנה כי לכידה של ארכיטקטורת הגידול ומאפייני השושלת של התא. בנוסף, 3D שיטות תרבות התא לאפשר צמיחה של תאים נורמליים להשוואה לתרבויות תאים סרטניים, אפשרי לעתים נדירות באמצעות 2D טכניקות תרבות התא. בשילוב, השימוש בתרבות תא של GEMMs ו 3D במחקרים קדם-קליניים יש את הפוטנציאל לשפר את הבנתנו את הביולוגיה של סרטן.

Introduction

מאז סוף שנות ה-80, היכולת לשנות גנים על ידי שילוב מחדש של הומוולוגי התקדמה מאוד במחקר של מערכות ביולוגיות1. Inducible, רקמה-, או תא ספציפי מערכות קידום האתר recombinases ספציפי, כגון היצור-loxp, יש מחקרים גנטיים מתקדמים על ידי הקלה על שליטה על שינויים גנטיים הן זמנית ו מרחב2,3, ד. השילוב של אסטרטגיות גנטיות אלה יצר מגוון רחב של מערכות מודל ניסיוני5,6,7.

מודלים של עכברים מהונדסים גנטית (GEMMs) הם כלי אינטגרלי כדי להעריך כיצד גנים בודדים או קבוצות של גנים משפיעים על פיתוח ומחלות היונקים. במחקר טרום קלינית לסרטן, GEMMs הם השיטה הפיזיולוגית ביותר הרלוונטית וקפדני ללמוד פיתוח סרטן, התקדמות, וטיפול8. המעבדה שלנו מתמחה בהפקת ואפיון של GEMMs סרטן.

הסרטן המאובחנים ביותר בקרב גברים בארצות הברית הוא סרטן הערמונית (PCa). רוב המטופלים עם PCa יש סיכון נמוך מחלה וסבירות גבוהה של הישרדות, אבל שיעורי הישרדות ירידה דרסטית כאשר המחלה מאובחנת בשלבים מתקדמים או אם טיפול הורמונלי ממוקד גורם התקדמות אגרסיבי, לא לריפוי PCa תת-סוגי9,10. המעבדה שלנו פיתחה GEMMs המשתמשים האללים של אחד או יותר גנים מדכא הגידול. שילוב ואובדן של הביטוי הגנטי מדכא הגידול מתרחשת במיוחד בבלוטת הערמונית, כי הצגנו transgene עם recombinase במורד הזרם של היזם פרוסין מופעל רק בתאי אפיתל הערמונית11, 12. יש לנו גם לגדל את ה-gemms שלנו להכיל את הכתבת שלנו שנקרא מקרא mT/mG, אשר משרה ביטוי חלבון פלורסנט העגבנייה בתאים חסרים היצורים הירוקים חלבון פלורסנט (gfp) ביטוי בתאים עם היצור13. בעוד המצגת של שיטה זו ותוצאות הנציג שלנו להראות GEMMs אנו לומדים במעבדה שלנו, פרוטוקול זה ניתן להשתמש כדי לייצר סרטן הערמונית אורגנואידים מכל מודל העכבר. עם זאת, כפי שנדונו בפירוט בסעיף התוצאות הנציג שלנו, הבחנו כי מאפייני הגידול מסוימים הם אופטימליים עבור הדור סרטן הערמונית אורגאיד.

בעשור האחרון, שיטות חדשות של תאים culturing מרקמות של מוצא אפיתל הובילו להתקדמות משמעותית ביכולתנו לדגמן מערכות איברים בתחום החוץ מבחנה14,15. המושג “3D תרבות התא” יוחסו טכניקות המעורבים בהקמת ושמירה על אורגנואידים, אשר ניתן להגדיר בדרך כלל מבנים העשויים מתאים להרכיב ארכיטקטורה משנית מונע על ידי אברי השושלת הספציפית האיברים מאפיינים16. שיטות חדשות אלה הן ברורות מתרבות התא דו-ממדית הקלאסית בתאים שאינם דורשים טרנספורמציה או התבגרות לצמיחה ארוכת טווח; כך, התרבויות 3D של תאים נורמליים ניתן להשוות לתאים חולים. זה בעל ערך רב במיוחד בחקר הסרטן שבו התרבויות נורמלי בקרת תאים בדרך כלל לא היה זמין. בנוסף, אורגנואידים בצורה ספונטנית ארכיטקטורות רקמה משנית עם סוגי תאים הבדיל כראוי, מה שהופך אותם מערכת מודל טוב יותר להבין סרטן באופן מתורבת מאשר 2D קווי התא17. המעבדה שלנו יצרה שורות 3D אורגאיד מבעיית הגידול מבודדים PCa שלנו GEMMs כדי להשלים את הנתונים שלנו vivo ולבצע ניסויים אשר לא יהיה ריאלי ב-GEMMs.

במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקולים כתובים וחזותיים עבור נקרופסי השלם של PCa GEMMs, כולל ניתוח של הערמונית ברורים העכבר נגעים גרורתית. אנו לתאר ולהראות צעד אחר צעד שיטה ליצירת אורגנואידים מפני גידולים בערמונית העכבר מבוסס על פרוטוקול שפורסם בעבר על-ידי Drost et al. עבור הנובעות אורגנואידים מרקמת הערמונית נורמלי עכבר אפיתל18.

Protocol

הליכים בעלי חיים המתוארים כאן בוצעו באישור של הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) במחלקה למשאבי בעלי חיים במעבדה, מרכז הסרטן ברוזוול, באפלו, ניו יורק. הערה: עכברים זכרים להיות גזור לבודד וגדלת או גידולים הערמונית עבור דור של אורגנואידים צריך לפחות להגיע לגיל של ב?…

Representative Results

הנציג תמונות נקרופסי של עכבר עם גידול הערמונית העיקרי ממולא נוזל באזור הערמונית הקדמי מוצגים באיור 2א. לעומת זאת, איור 2B, הצגת תמונות מייצגים נקרוסי של עכבר עם גידול מוצק גדול הערמונית העיקרי שבהם אזורי הערמונית בודדים אינם זהים. תמונות ל?…

Discussion

צעדים קריטיים בפרוטוקול לניתוח גידול בערמונית ויצירת אורגנואיד
הסרת רקמת הערמונית וניתוח עדין של הגידול בערמונית העכבר הוא חיוני עבור הדור האופטימלי של הסרטן אורגנואידים מאז הן תאים אפיתל שאינם הערמונית תאים אפיתל הערמונית נורמלי לייצר אורגנואידים. עבור גידולים בערמונית מו?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים רוצים להודות המעבדה קלווין קואו באוניברסיטת סטנפורד לאספקת תאים HEK293 באופן מאוד מנוכר עם העכבר הראש או העכבר Rspo1-Fc. אנחנו גם רוצים להודות לד ר הדיקן טאנג על שאיפשר לנו לגשת למיקרוסקופ לניתוח פלורסנט במעבדה שלו. עבודה זו נתמכת על ידי CA179907 כדי D.W.G. מן המכון הלאומי לסרטן. משאבים משותפים בפארק רוזוול מקיף הסרטן המרכז היו נתמכים על ידי המכון הלאומי לסרטן בריאות המרכז תמיכה גרנט CA016056.

Materials

0.25 % Trypsin+2.21 mM EDTA Sigma 25-053
1 1/4 in, 23 gauge, disposable syringe needles Becton Dickinson Z192430
10 % neutral buffered formalin Sigma HT501128
32 % paraformaldehyde Electron Microscopy Services 15714
A83-01 MedChemExpress HY-10432
Advanced DMEM/F12+++ Gibco 12634
Analytical balance Mettler Toledo 30216623
B27 (50X) Gibco 17504044
Collagenase II Gibco 17101015
Dissecting Board Thermo-Fisher 36-1
EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10 Manufactured by Trevigen Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix
HEPES (1M) Sigma 25-060
human recombinant Epidermal growth factor (EGF) PeproTech AF-100-15
L-glutamine (200 mM) Sigma 25-005
N-Acetyl-L-Cysteine Sigma A9165
Penicillin-Streptomycin Sigma P4333
Precision balance Mettler Toledo 30216561
Scalpel #23 World Precision Instruments 504176
Scalpel Handle #7, 16 cm World Precision Instruments 500238
Single-edge carbon razor blade Fisherbrand 12-640
Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight World Precision Instruments 14393
Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated World Precision Instruments 15915
Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated World Precision Instruments 504489
Y-276632 (Rock Inhibitor) APExBIO A3008

References

  1. Capecchi, M. R. Altering the genome by homologous recombination. Science. 244 (4910), 1288-1292 (1989).
  2. Furth, P. A., et al. Temporal control of gene expression in transgenic mice by a tetracycline-responsive promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (20), 9302-9306 (1994).
  3. Aranda, M., et al. Altered directionality in the Cre-LoxP site-specific recombination pathway. Journal of Molecular Biology. 311 (3), 453-459 (2001).
  4. Schwenk, F., Kuhn, R., Angrand, P. O., Rajewsky, K., Stewart, A. F. Temporally and spatially regulated somatic mutagenesis in mice. Nucleic Acids Research. 26 (6), 1427-1432 (1998).
  5. Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).
  6. Goodrich, M. M., Talhouk, R., Zhang, X., Goodrich, D. W. An approach for controlling the timing and order of engineered mutations in mice. Genesis. 56 (8), 23242 (2018).
  7. Brocard, J., et al. Spatio-temporally controlled site-specific somatic mutagenesis in the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14559-14563 (1997).
  8. Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges. Cell. 163 (1), 39-53 (2015).
  9. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA: A Cancer Journal for Clinicians. , (2019).
  10. Bluemn, E. G., et al. Androgen Receptor Pathway-Independent Prostate Cancer Is Sustained through FGF Signaling. Cancer Cell. 32 (4), 474-489 (2017).
  11. Zhou, Z., et al. Synergy of p53 and Rb deficiency in a conditional mouse model for metastatic prostate cancer. Cancer Research. 66 (16), 7889-7898 (2006).
  12. Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
  13. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  14. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  15. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  16. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  17. Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
  18. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
  19. Oliveira, D. S., et al. The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline. Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).
  20. Callis, G., Sterchi, D. Decalcification of Bone: Literature Review and Practical Study of Various Decalcifying Agents, Methods, and Their Effects on Bone Histology. The Journal of Histotechnology. (21), 49-58 (1998).
  21. Dardenne, E., et al. N-Myc Induces an EZH2-Mediated Transcriptional Program Driving Neuroendocrine Prostate Cancer. Cancer Cell. 30 (4), 563-577 (2016).
  22. Blattner, M., et al. SPOP Mutation Drives Prostate Tumorigenesis In Vivo through Coordinate Regulation of PI3K/mTOR and AR Signaling. Cancer Cell. 31 (3), 436-451 (2017).
  23. Agarwal, S., et al. Identification of Different Classes of Luminal Progenitor Cells within Prostate Tumors. Cell Reports. 13 (10), 2147-2158 (2015).

Play Video

Cite This Article
Wadosky, K. M., Wang, Y., Zhang, X., Goodrich, D. W. Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer. J. Vis. Exp. (148), e59710, doi:10.3791/59710 (2019).

View Video