Generazione di organidi tumorali da modelli murini geneticamente ingegnerizzati del cancro alla prostata

Dalla fine degli anni ’80, la capacità di alterare i geni con la ricombinazione omologa ha notevolmente avanzato lo studio dei sistemi biologici¹. Sistemi promotori inducibili, tissutali o specifici delle cellule e ricombinazioni site-specific, come Cre-loxP, ha avanzato studi genetici facilitando il controllo sulle modifiche genetiche sia dal punto di vista temporale che spaziale^{2,3, 4}. La combinazione di queste strategie genetiche ha creato una vasta gamma di sistemi di modelli sperimentali^5,6,7.

I modelli murini geneticamente progettati (GEMM) sono uno strumento integrale per valutare in che modo i singoli geni o gruppi di geni influenzano lo sviluppo e la malattia dei mammiferi. Nella ricerca pre-clinica sul cancro, le GEMM sono il metodo più fisiologicamente rilevante e rigoroso per studiare lo sviluppo, la progressione e il trattamento del cancro⁸. Il nostro laboratorio è specializzato nella generazione e nella caratterizzazione delle GEMM tumorali.

Il cancro non cutaneo più altamente diagnosticato tra gli uomini negli Stati Uniti è il cancro alla prostata (PCa). La maggior parte dei pazienti con PCa ha una malattia a basso rischio e un’elevata probabilità di sopravvivenza, ma i tassi di sopravvivenza diminuiscono drasticamente quando la malattia viene diagnosticata in stadi avanzati o se la terapia ormonale mirata induce la progressione a PCa aggressiva e non curabile sottotipi^9,10. Il nostro laboratorio ha sviluppato GEMM che utilizzano alleli sxed di uno o più geni soppressori tumorali. La ricombinazione e la perdita dell’espressione genica del soppressore tumorale si verifica specificamente nella prostata perché abbiamo introdotto un transgene con Cre ricombinase a valle del promotore probasinattivato attivato solo nelle cellule epiteliali prostata^{11, 12.}Abbiamo anche allevato le nostre GEMM per contenere un Transgene Cre reporter chiamato mT/mG, che induce l’espressione delle proteine fluorescenti di pomodoro in cellule prive di Cre e proteina fluorescente verde (GFP) espressione nelle cellule con Cre¹³. Mentre la presentazione di questo metodo e i nostri risultati rappresentativi mostrano gemm che studiamo nel nostro laboratorio, questo protocollo può essere utilizzato per generare organoidi di cancro alla prostata da qualsiasi modello murino. Tuttavia, come discusso in dettaglio nella nostra sezione dei risultati rappresentativi, abbiamo osservato che alcune caratteristiche del tumore sono ottimali per la generazione di organoidi per il cancro alla prostata.

Nell’ultimo decennio, nuovi metodi di coltura delle cellule dai tessuti di origine epiteliale hanno portato a progressi significativi nella nostra capacità di modellare i sistemi di organi in vitro^14,15. Il termine “coltura cellulare 3D” è stato attribuito alle tecniche coinvolte nella definizione e manutenzione degli organoidi, che possono essere generalmente definite come strutture costituite da cellule che assemblano l’architettura secondaria guidata dal lignaggio cellulare specifico dell’organo caratteristiche¹⁶. Questi nuovi metodi sono distinti dalla cultura cellulare 2D classica in quanto le celle non richiedono trasformazione o immortalizzazione per la crescita a lungo termine; pertanto, le colture 3D delle cellule normali possono essere confrontate con le cellule malate. Ciò è particolarmente utile nella ricerca sul cancro, dove le normali colture di controllo cellulare non sono state in genere disponibili. Inoltre, gli organoidi formano spontaneamente architetture di tessuti secondari con tipi di cellule opportunamente differenziate, rendendoli un sistema modello migliore per comprendere il cancro in vitro rispetto alle linee cellulari 2D¹⁷. Il nostro laboratorio ha creato linee organoidi 3D da un problema tumorale isolato dai nostri GEMM PCa per integrare i nostri dati in vivo ed eseguire esperimenti che non sarebbero fattibili nei GEMM.

In questo articolo, presentiamo protocolli scritti e visivi per la necropsia completa delle PCa GEMMs, tra cui la dissezione di lobi della prostata del topo distinti e lesioni metastatiche. Descriviamo e mostriamo un metodo passo-passo per generare organoidi da tumori della prostata del topo sulla base di un protocollo precedentemente pubblicato da Drost et al. per la derivazione di organoidi dal normale tessuto epiteliale della prostata del topo¹⁸.