Generación de organoides tumorales a partir de modelos de ratón de ingeniería genética del cáncer de próstata

Desde finales de la década de 1980, la capacidad de alterar genes mediante la recombinación homóloga ha avanzado en gran medida el estudio de los sistemas biológicos¹. Los sistemas promotores inducibles, tisulares o celulares específicos y las recombinaciones específicas del sitio, como Cre-loxP, tienen estudios genéticos avanzados al facilitar el control de las modificaciones genéticas tanto temporal como espacialmente^{2,3, 4}. La combinación de estas estrategias genéticasha creado una amplia gama de sistemas de modelos experimentales 5,^6,7.

Los modelos de ratón de ingeniería genética (GEM) son una herramienta integral para evaluar cómo los genes individuales o grupos de genes afectan el desarrollo y la enfermedad de los mamíferos. En la investigación preclínica del cáncer, los GEMM son el método más fisiológicamente relevante y riguroso para estudiar el desarrollo, progresión y tratamiento del cáncer^8. Nuestro laboratorio se especializa en la generación y caracterización de GEM DeNado sin cáncer.

El cáncer no cutáneo más altamente diagnosticado entre los hombres en los Estados Unidos es el cáncer de próstata (PCa). La mayoría de los pacientes con PCa tienen enfermedad de bajo riesgo y alta probabilidad de supervivencia, pero las tasas de supervivencia disminuyen drásticamente cuando la enfermedad se diagnostica en etapas avanzadas o si la terapia hormonal dirigida induce la progresión a la PCa agresiva y no curable subtipos^9,10. Nuestro laboratorio ha desarrollado GEMMs que utilizan alelos floxed de uno o más genes supresores de tumores. La recombinación y la pérdida de la expresión génica supresora tumoral se produce específicamente en la próstata porque hemos introducido un transgén con Cre recombinase aguas abajo del promotor probasin activado sólo en las células epiteliales de próstata^{11, 12}. También hemos criado nuestros GEMMs para contener un transgén de reportero Cre llamado mT/mG, que induce la expresión de proteína fluorescente de tomate en células que carecen de Cre y proteína fluorescente verde (GFP) expresión en células con Cre¹³. Si bien la presentación de este método y nuestros resultados representativos muestran GEMMs que estudiamos en nuestro laboratorio, este protocolo se puede utilizar para generar organoides de cáncer de próstata a partir de cualquier modelo de ratón. Sin embargo, como se discutió en detalle en nuestra sección de resultados representativos, hemos observado que ciertas características tumorales son óptimas para la generación de organoides de cáncer de próstata.

En la última década, nuevos métodos de cultivo de células de tejidos de origen epitelial han dado lugar a avances significativos en nuestra capacidad de modelar sistemas de órganos in vitro^14,15. El término “cultivo celular 3D” se ha atribuido a las técnicas involucradas en el establecimiento y mantenimiento de organoides, que generalmente pueden definirse como estructuras compuestas por células que ensamblan arquitectura secundaria impulsada por el linaje celular específico de órganos características¹⁶. Estos nuevos métodos son distintos del cultivo celular 2D clásico en que las células no requieren transformación o inmortalización para el crecimiento a largo plazo; por lo tanto, los cultivos 3D de células normales se pueden comparar con las células enfermas. Esto es particularmente valioso en la investigación del cáncer donde los cultivos normales de control celular no han estado típicamente disponibles. Además, los organoides forman espontáneamente arquitecturas de tejidos secundarios con tipos celulares adecuadamente diferenciados, lo que los convierte en un mejor sistema modelo para entender el cáncer in vitro que las líneas celulares 2D^17. Nuestro laboratorio ha creado líneas organoides 3D a partir de problemas tumorales aislados de nuestros GemM PCa para complementar nuestros datos in vivo y realizar experimentos que no serían factibles en GEMMs.

En este artículo, presentamos protocolos escritos y visuales para la necropsia completa de los GEM DeP PCa, incluyendo la disección de diferentes lóbulos de la próstata del ratón y lesiones metastásicas. Describimos y mostramos un método paso a paso para generar organoides a partir de tumores de próstata de ratón basado en un protocolo publicado previamente por Drost et al. para derivar organoides del tejido epitelial de próstata de ratón normal¹⁸.