Endotel hücrelerinden RNA yalıtım için Ribosome affinity arıtma (TRAP) çevirisi In vivo
Summary
Eğer RNA arıtma ile birlikte ribozomlarda içinde gelişmiş yeşil floresan proteinin (EGFP) EC özgü genetik etiketi ile doğrudan fare beyin, akciğer ve kalp dokularda vasküler endotel hücrelerden (ECS) ribosome bağlı mRNA arındırmak için bir yaklaşım sunuyoruz .
Abstract
Birçok çalışma, in vitro hücresel kullanım ve tüm dokularda veya qPCR ve RNA sıralamaları ile transkriptom ve Gen ifadesinin in vitro analizi için hayvanlardan belirli hücre türlerinin yalıtılması ile sınırlıdır. Kompleks dokularda ve organlardaki spesifik hücre türlerinin kapsamlı transkriptom ve gen ifadesi analizi, genlerin düzenlendiği ve doku homeostaz ve organ ile ilişkisini gösteren hücresel ve moleküler mekanizmaları anlamak için önemli olacaktır. Işlev. Bu yazıda, bir örnek olarak hayvan akciğerleri vasküler endotelinde doğrudan içinde vivo ribosome bağlı RNA yalıtım metodolojisi göstermektedir. Doku işleme ve RNA arıtma için özel malzeme ve yordamlar, RNA kalite ve verim yanı sıra gerçek zamanlı qPCR arteriogenic geni için değerlendirilmesi de dahil olmak üzere tarif edilecektir. Ribozom yakınlık arıtma (Trap) tekniği tercüme olarak bilinen bu yaklaşım, karmaşık dokularda herhangi bir belirli tip doğrudan in vivo gen ifade ve transkriptom analiz belirli hücre türlerinin karakterizasyonu için kullanılabilir.
Introduction
Meme beyni, kalp ve akciğer gibi kompleks dokularda, yüksek seviyede hücresel heterojenlik, tüm doku örneklerinden elde edilen gen ifade verilerinin analizini zorlaştırmaya çalışmaktadır. Belirli bir hücre türü içinde vivo gen ifade profillerini gözlemlemek için, yeni bir metodoloji son zamanlarda, hangi tüm tercüme mRNA herhangi bir genetik olarak tanımlanan hücre türünün tamamlayıcı sorgulama sağlar geliştirilmiştir. Bu metodoloji tercüme ribozom benzeşimi arıtma (Trap) tekniği1,2olarak bilinir. Genetiği değiştirilmiş diğer anjiyogenesis ile birlikte zaman endotel hücre biyoloji ve anjiyojenezi incelemek için yararlı bir araçtır hayvanlar.
Anjiyojenik PKD-1 sinyalizasyon ve anjiyojenik gen CD36 transkripsiyonu endotel hücre (EC) farklılaşma ve fonksiyonel anjiyogenez3,4,5,6için kritik olduğunu göstermiştir. Gen transkripsiyonu ve EC transfarklılaşmasında anjiyojenik ve metabolik sinyalizasyon moleküler mekanizmalarını belirlemek için, TRAP tekniği temelinde özellikle silinmiş anjiyojenik genler ile genetik olarak tasarlanan TRAP fareler oluşturduk1 , 2. dahası, bizim Trap hayvanlar, sadece onlar PKD-1 veya cd36 gen eksikliği vasküler endotelinde veya cd36 geni küresel silme, ancak gelişmiş bir yeşil floresan protein (EGFP) aynı zamanda genetik üzerine Etiketlenmiş AK ‘s tercüme ribosomes. TRAP, doğrudan ribosome bağlı mRNA ‘nın, hedeflenen dokuların vasküler endothelinden, Gen ifadesinin analizine ve EC farklılaşması ile ilişkili yeni transcriptomlerin tanımlanmasına imkan tanır. doğrudan in vivo koşullarda anjiyogenez. Genetik olarak tasarlanan bu hayvanlarda endotelinde ‘dan ribosome bağlı RNA ‘yı başarıyla izole ettik. Arıtılmış RNA, ak farklılaşma ve fonksiyonların düzenlenmesinde anjiyojenik veya arteriojen genlerin daha fazla karakterize edilmesi için kullanılabilir. Bu protokol, doğrudan in vivo ECs içinde mRNA yalıtımı için TRAP yaklaşımı uygulamak için adım adım bir kılavuz sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anjiyojenez, EC ‘e özgü anjiyojenik Gen transkripsiyonu ve ifadesinin ak farklılaşma ve anjiyojenik reprogramlama3,4‘ te önemli bir rol oynadığı karmaşık bir çok adımlı süreçtir. Bir moleküler düzeyde memelili vasküler sistemin fonksiyonunu daha iyi anlamak için hücresel çeşitlilik ve mimari karmaşıklığı engelleri aşmak için, biz EC özgü TRAP fareler oluşturduk, EC özgü cd36 ile birlikte , EC özgü PKD-1 eksik…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr Ren ‘in çalışmaları Amerikan Kalp Derneği tarafından desteklenmektedir (13, 14800019; BR), Ann ‘in umut Vakfı (FP00011709; BR), Amerikan Kanser Derneği (86-004-26; MCW Kanser Merkezi BR) ve Ulusal Sağlık Enstitüsü (HL136423; BR); Jordan Palmer 2018 MCW CTSı 500 yıldız staj programı tarafından desteklenmektedir; P. Moran, NHLBı ‘dan (5T35 HL072483-34) kurumsal araştırma eğitim hibe tarafından desteklenmektedir.
Materials
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer with Nanochips and Picochips | Agilent | G2939AA, 5067-1511 & 5067-1513 | |
| Cell scrapers | Sarstedt | 83.1832 | |
| Homogenizers | Fisher Scientific | K8855100020 | |
| Magnet (Dynamag-2) | Invitrogen | 123-21D | Will depend on purification scale; samples in 1.5-mL tubes can be concentrated on a DynaMag-2 |
| Minicentrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| NanoDrop 2000C spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000C | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5430R | with rotor for 1.5-mL microcentrifuge tubes |
| RNase-free 1.5mL microcentrifuge tubes | Applied Biosystems | AM12450 | |
| Rnase-free 50-mL conical tubes | Applied Biosystems | AM12501 | |
| RNase-free 1000-μl filter tips | Rainin | RT-1000F | |
| RNase-free 200-μl filter tips | Rainin | RT-200F | |
| RNase-free 20-μl filter tips | Rainin | RT-20F | |
| Rotor for homogenizers | Yamato | LT-400D | |
| Tube rotator, Labquake brand | Thermo Fisher | 13-687-12Q |
References
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).
- Zhou, P., et al. Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).
- Best, B., Moran, P., Ren, B. VEGF/PKD-1 signaling mediates arteriogenic gene expression and angiogenic responses in reversible human microvascular endothelial cells with extended lifespan. Molecular and Cellular Biochemistry. 446, 199-207 (2018).
- Ren, B., et al. LPA/PKD-1-FoxO1 Signaling Axis Mediates Endothelial Cell CD36 Transcriptional Repression and Proangiogenic and Proarteriogenic Reprogramming. Arteriosclerosclerosis Thrombosis, Vascular Biology. 36, 1197-1208 (2016).
- Ren, B. Protein Kinase D1 Signaling in Angiogenic Gene Expression and VEGF-Mediated Angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 37 (2016).
- Ren, B. FoxO1 transcriptional activities in VEGF expression and beyond: a key regulator in functional angiogenesis?. Journal of Pathology. 245, 255-257 (2018).
- Hupe, M., Li, M. X., Gertow Gillner, K., Adams, R. H., Stenman, J. M. Evaluation of TRAP-sequencing technology with a versatile conditional mouse model. Nucleic Acids Research. 42, e14 (2014).
- Dong, L., et al. Diet-induced obesity links to ER positive breast cancer progression via LPA/PKD-1-CD36 signaling-mediated microvascular remodeling. Oncotarget. 8, 22550-22562 (2017).
- Ren, B., et al. ERK1/2-Akt1 crosstalk regulates arteriogenesis in mice and zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 120, 1217-1228 (2010).
- Skuli, N., et al. Endothelial HIF-2alpha regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes. Journal of Clinical Investigation. 122, 1427-1443 (2012).
