ترجمة تنقية التقارب الريبوسم (TRAP) لعزل الحمض النووي الريبي عن الخلايا البطانية في الجسم الحي
Summary
نقدم نهجا ً لتنقية الرَّناة الرَّاقيزة المنوّجة الوعائية من الخلايا البطانية الوعائية (ECs) مباشرة في أنسجة الدماغ والرئة والقلب باستخدام الأنسجة الوراثية الخاصة بالجماعة الأوروبية للبروتين الفلوري الأخضر المعزز (EGFP) في ريبوسوسوم بالاشتراك مع تنقية الحمض النووي الريبي .
Abstract
وقد اقتصرت العديد من الدراسات على استخدام الاختبارات الخلوية في المختبر والأنسجة الكاملة أو عزل أنواع محددة من الخلايا عن الحيوانات لتحليل هامدة في المختبر للتعبير الجيني عن طريق تسلسل qPCR وRNA. تحليل شامل للنسخ والتعبير الجيني لأنواع محددة من الخلايا في الأنسجة والأعضاء المعقدة سيكون حاسما لفهم الآليات الخلوية والجزيئية التي يتم تنظيم الجينات وارتباطها مع التوازن الأنسجة والجهاز وظائف. في هذه المقالة، نقوم بتوضيح منهجية عزل الحمض النووي الريبي المرتبط مباشرة في الجسم الحي في بطانة الأوعية الدموية من الرئتين الحيوانية كمثال. وسيتم وصف المواد والإجراءات المحددة لمعالجة الأنسجة وتنقية الحمض النووي الريبي، بما في ذلك تقييم نوعية الحمض النووي الريبي والغلة، فضلا عن qPCR في الوقت الحقيقي لتجارب الجينات الشريانية. ويمكن استخدام هذا النهج، المعروف باسم ترجمة تقنية تنقية التقارب الريبوسوم (TRAP)، لتوصيف التعبير الجيني وتحليل النسخ لبعض أنواع الخلايا مباشرة في الجسم الحي في أي نوع محدد في الأنسجة المعقدة.
Introduction
في الأنسجة المعقدة مثل الدماغ الثدييات والقلب والرئة، والمستويات العالية من التباين الخلوي تعقيد تحليل بيانات التعبير الجيني المستمدة من عينات الأنسجة بأكملها. لمراقبة ملامح التعبير الجيني في نوع معين من الخلايا في الجسم الحي، تم تطوير منهجية جديدة مؤخرا، والتي تسمح باستجواب كامل mRNA المترجمة تكملة من أي نوع الخلية المعرفة وراثيا. وتعرف هذه المنهجية باسم ترجمة تنقية التقارب الريبوسم (TRAP) تقنية1،2. وهو أداة مفيدة لدراسة بيولوجيا الخلايا البطانية وتكوين الأوعية الدموية عند الجمع بين التلاعب وراثيا الجينات الأخرى المرتبطة بتكوين الأوعية الدموية في الحيوانات.
لقد أظهرنا أن إشارات PKD-1 الوعائية ونسخ الجينات الوعائية CD36 أمران حاسمان للتمايز في الخلايا البطانية (EC) وتكوين الأوعية الدموية الوظيفي3و4و5 و6. لتحديد الآليات الجزيئية للإشارات الوعائية والأيضية في نسخ الجينات والتحويل عبر EC، أنشأنا فئران TRAP المهندسة وراثيا مع الجينات الوعائية المحذوفة على وجه التحديد على أساس تقنية TRAP1 , 2.وعلاوة على ذلك، في الحيوانات TRAP لدينا، ليس فقط لديهم pkd-1 أو cd36 نقص الجينات في بطانة الأوعية الدموية أو الحذف العالمي للجين cd36، ولكن يتم أيضا وضع علامة وراثيا على بروتين الفلورة الخضراء المعززة (EGFP) وراثيا على المفوضية الأوروبية تترجم الريبوسوسوم. يسمح TRAP بتنقية الرصانة الرائية الريبوسومية مباشرة من بطانة الأوعية الدموية للأنسجة المستهدفة، مما يتيح تحليل التعبير الجيني وتحديد النسخ الجديدة المرتبطة بالتمايز مع الجماعة الأوروبية و تكوين الأوعية الدموية مباشرة تحت في ظروف الجسم الحي. لقد نجحنا في عزل الحمض النووي الريبي من بطانة الرحم في هذه الحيوانات المهندسة وراثيا. يمكن استخدام الحمض النووي الريبي النقي لمزيد من التوصيف للجينات الوعائية أو الشريانية في تنظيم تمايز الجماعة الأوروبية ووظائفها. يوفر هذا البروتوكول دليل خطوة بخطوة لتنفيذ نهج TRAP لعزل mRNA في ECs مباشرة في الجسم الحي.
Protocol
Representative Results
Discussion
تكوين الأوعية الدموية هو عملية معقدة متعددة الخطوات، حيث النسخ الجيني الوعائي الخاص بالجماعة الأوروبية وتعبيره يلعب دورا أساسيا في تمايز الجماعة الأوروبية وإعادة برمجة الأوعية الدموية3،4. للتغلب على الحواجز الناجمة عن التنوع الخلوي والتعقيد المعماري لفه…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم عمل الدكتور رين من قبل جمعية القلب الأمريكية (13SDG14800019; BR)، مؤسسة أمل آن (FP00011709؛ BR)، والجمعية الأمريكية للسرطان (86-004-26؛ ومركز السرطان MCW إلى BR)، والمعهد الوطني للصحة (HL136423؛ BR)؛ ويدعم الأردن بالمر من قبل 2018 MCW CTSI 500 نجوم برنامج التدريب; P. موران مدعوم من منحة التدريب على البحوث المؤسسية من NHLBI (5T35 HL072483-34).
Materials
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer with Nanochips and Picochips | Agilent | G2939AA, 5067-1511 & 5067-1513 | |
| Cell scrapers | Sarstedt | 83.1832 | |
| Homogenizers | Fisher Scientific | K8855100020 | |
| Magnet (Dynamag-2) | Invitrogen | 123-21D | Will depend on purification scale; samples in 1.5-mL tubes can be concentrated on a DynaMag-2 |
| Minicentrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| NanoDrop 2000C spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000C | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5430R | with rotor for 1.5-mL microcentrifuge tubes |
| RNase-free 1.5mL microcentrifuge tubes | Applied Biosystems | AM12450 | |
| Rnase-free 50-mL conical tubes | Applied Biosystems | AM12501 | |
| RNase-free 1000-μl filter tips | Rainin | RT-1000F | |
| RNase-free 200-μl filter tips | Rainin | RT-200F | |
| RNase-free 20-μl filter tips | Rainin | RT-20F | |
| Rotor for homogenizers | Yamato | LT-400D | |
| Tube rotator, Labquake brand | Thermo Fisher | 13-687-12Q |
References
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).
- Zhou, P., et al. Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).
- Best, B., Moran, P., Ren, B. VEGF/PKD-1 signaling mediates arteriogenic gene expression and angiogenic responses in reversible human microvascular endothelial cells with extended lifespan. Molecular and Cellular Biochemistry. 446, 199-207 (2018).
- Ren, B., et al. LPA/PKD-1-FoxO1 Signaling Axis Mediates Endothelial Cell CD36 Transcriptional Repression and Proangiogenic and Proarteriogenic Reprogramming. Arteriosclerosclerosis Thrombosis, Vascular Biology. 36, 1197-1208 (2016).
- Ren, B. Protein Kinase D1 Signaling in Angiogenic Gene Expression and VEGF-Mediated Angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 37 (2016).
- Ren, B. FoxO1 transcriptional activities in VEGF expression and beyond: a key regulator in functional angiogenesis?. Journal of Pathology. 245, 255-257 (2018).
- Hupe, M., Li, M. X., Gertow Gillner, K., Adams, R. H., Stenman, J. M. Evaluation of TRAP-sequencing technology with a versatile conditional mouse model. Nucleic Acids Research. 42, e14 (2014).
- Dong, L., et al. Diet-induced obesity links to ER positive breast cancer progression via LPA/PKD-1-CD36 signaling-mediated microvascular remodeling. Oncotarget. 8, 22550-22562 (2017).
- Ren, B., et al. ERK1/2-Akt1 crosstalk regulates arteriogenesis in mice and zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 120, 1217-1228 (2010).
- Skuli, N., et al. Endothelial HIF-2alpha regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes. Journal of Clinical Investigation. 122, 1427-1443 (2012).
