생체 내피 세포에서 RNA 격리를 위한 리보솜 친화성 정제(TRAP) 번역
Summary
우리는 RNA 정화와 결합된 리보솜에 있는 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP)의 EC 특정 유전 꼬리표를 통해 마우스 두뇌, 폐 및 심혼 조직에서 직접 혈관 내피 세포 (Ec)에서 리보솜 결합mRNA를 정화하는 접근을 제시합니다 .
Abstract
많은 연구는 qPCR 및 RNA 염기서열 분석에 의한 전사체 및 유전자 발현의 시험관 내 분석을 위해 동물로부터 시험관 내 세포 분석 및 전체 조직 또는 특정 세포 유형을 분리하는 것으로 제한되었습니다. 복잡한 조직 및 기관에 있는 특정 세포 모형의 포괄적인 전사체 그리고 유전자 발현 분석은 유전자가 통제되는 세포와 분자 기계장치를 이해하고 조직 항상성 및 기관과의 그들의 협회를 이해하는 것이 중요합니다 함수. 이 기사에서는, 우리는 예를 들어 동물 폐의 혈관 내피에서 생체 내에서 직접 리보솜 결합 RNA의 격리를위한 방법론을 보여줍니다. 조직 처리 및 RNA 정제를 위한 특정 물질 및 절차는 동맥 생성 유전자 검정을 위한 RNA 질 및 수율의 평가 뿐만 아니라 실시간 qPCR를 포함하여 기술될 것이다. 리보솜 친화도 정제(TRAP) 기술로 알려진 이 접근법은 복잡한 조직에서 임의의 특정 유형에서 생체 내에서 직접 특정 세포 유형의 유전자 발현 및 전사체 분석의 특성화에 활용될 수 있다.
Introduction
포유류 뇌, 심장 및 폐와 같은 복잡한 조직에서는 높은 수준의 세포 이질성이 전체 조직 샘플에서 파생된 유전자 발현 데이터의 분석을 복잡하게 만듭니다. 생체 내에서 특정 세포 유형에서 유전자 발현 프로파일을 관찰하기 위해, 새로운 방법론이 최근에 개발되었으며, 이는 임의의 유전자 정의 세포 유형의 전체 번역 된 mRNA 보체의 심문을 허용한다. 이 방법론은 리보솜 친화도 정제(TRAP) 기술1,2. 그것은 동물에 있는 그밖 혈관신생 관련 유전자를 유전으로 조작과 결합될 때 내피 세포 생물학 및 혈관 신생을 공부하는 유용한 공구입니다.
혈관신생 PKD-1 신호및 혈관신생 유전자 CD36의 전사가 내피세포(EC) 분화 및 기능성 혈관신생3,4,5,6에중요하다는 것을 보여주었다. 유전자 전사 및 EC 분화에서 혈관 신생 및 대사 신호의 분자 메커니즘을 결정하기 위해 TRAP 기술 1을 기반으로 특별히 삭제 된 혈관 신생 유전자를 사용하여 유전자 조작 TRAP 마우스를 만들었습니다1 , 2. 또한, 우리의 TRAP 동물에서, 뿐만 아니라 그들은 혈관 내피 또는 cd36 유전자의 글로벌 삭제에 pkd-1 또는 cd36 유전자 결핍을 가지고 있지만, 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP)도 유전적으로 태그 EC의 번역 리보솜. TRAP은 표적 조직의 혈관 내피에서 직접 리보솜 결합 mRNA의 친화도 정제를 허용하여 유전자 발현 및 EC 분화와 관련된 새로운 전사체의 식별을 가능하게 하며, 생체 내 조건 하에서 직접 혈관 신생. 우리는 성공적으로 이 유전으로 조작된 동물에 있는 내피에서 리보솜 바인딩된 RNA를 격리했습니다. 정제된 RNA는 EC 분화 및 기능의 조절에서 혈관신생 또는 동맥신생 유전자의 추가 특성화에 사용될 수 있다. 이 프로토콜은 생체 내에서 직접 ECs에서 mRNA의 격리를 위한 TRAP 접근법을 구현하는 단계별 가이드를 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
혈관신생은 복잡한 다단계 과정으로, EC 특이적 혈관신생 유전자 전사 및 발현이 EC 분화 및 혈관신생 재프로그래밍에 필수적인 역할을 하는3,4. 생체 내 분자 수준에서 포유류 혈관 시스템의 기능을 더 잘 이해하기 위한 세포 다양성 및 건축 적 복잡성의 장벽을 극복하기 위해 EC 특이적 CD36과 함께 EC 특이적 TRAP 마우스를 만들었습니다. , EC 특이적…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
렌 박사의 작품은 미국 심장 협회 (13SDG14800019)에 의해 지원됩니다. BR), 앤스 호프 재단 (FP00011709; BR), 미국 암 학회 (86-004-26; MCW 암 센터 BR), 그리고 건강의 국립 연구소 (HL136423; BR); 조던 파머는 2018 MCW CTSI 500 스타 인턴십 프로그램에 의해 지원됩니다. P. 모란은 NHLBI (5T35 HL072483-34)의 기관 연구 교육 보조금에 의해 지원됩니다.
Materials
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer with Nanochips and Picochips | Agilent | G2939AA, 5067-1511 & 5067-1513 | |
| Cell scrapers | Sarstedt | 83.1832 | |
| Homogenizers | Fisher Scientific | K8855100020 | |
| Magnet (Dynamag-2) | Invitrogen | 123-21D | Will depend on purification scale; samples in 1.5-mL tubes can be concentrated on a DynaMag-2 |
| Minicentrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| NanoDrop 2000C spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000C | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5430R | with rotor for 1.5-mL microcentrifuge tubes |
| RNase-free 1.5mL microcentrifuge tubes | Applied Biosystems | AM12450 | |
| Rnase-free 50-mL conical tubes | Applied Biosystems | AM12501 | |
| RNase-free 1000-μl filter tips | Rainin | RT-1000F | |
| RNase-free 200-μl filter tips | Rainin | RT-200F | |
| RNase-free 20-μl filter tips | Rainin | RT-20F | |
| Rotor for homogenizers | Yamato | LT-400D | |
| Tube rotator, Labquake brand | Thermo Fisher | 13-687-12Q |
References
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).
- Zhou, P., et al. Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).
- Best, B., Moran, P., Ren, B. VEGF/PKD-1 signaling mediates arteriogenic gene expression and angiogenic responses in reversible human microvascular endothelial cells with extended lifespan. Molecular and Cellular Biochemistry. 446, 199-207 (2018).
- Ren, B., et al. LPA/PKD-1-FoxO1 Signaling Axis Mediates Endothelial Cell CD36 Transcriptional Repression and Proangiogenic and Proarteriogenic Reprogramming. Arteriosclerosclerosis Thrombosis, Vascular Biology. 36, 1197-1208 (2016).
- Ren, B. Protein Kinase D1 Signaling in Angiogenic Gene Expression and VEGF-Mediated Angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 37 (2016).
- Ren, B. FoxO1 transcriptional activities in VEGF expression and beyond: a key regulator in functional angiogenesis?. Journal of Pathology. 245, 255-257 (2018).
- Hupe, M., Li, M. X., Gertow Gillner, K., Adams, R. H., Stenman, J. M. Evaluation of TRAP-sequencing technology with a versatile conditional mouse model. Nucleic Acids Research. 42, e14 (2014).
- Dong, L., et al. Diet-induced obesity links to ER positive breast cancer progression via LPA/PKD-1-CD36 signaling-mediated microvascular remodeling. Oncotarget. 8, 22550-22562 (2017).
- Ren, B., et al. ERK1/2-Akt1 crosstalk regulates arteriogenesis in mice and zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 120, 1217-1228 (2010).
- Skuli, N., et al. Endothelial HIF-2alpha regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes. Journal of Clinical Investigation. 122, 1427-1443 (2012).
