Traducción de la purificación de afinidad de ribosoma (TRAP) para el aislamiento de ARN de células endoteliales in vivo
Summary
Presentamos un enfoque para purificar el ARNm ligado al ribosoma a partir de células endoteliales vasculares (OC) directamente en el cerebro del ratón, los pulmones y los tejidos cardíacos a través de la etiqueta genética específica de la CE de la proteína de fluorescencia verde mejorada (EGFP) en ribosomas en combinación con la purificación del ARN .
Abstract
Muchos estudios se han limitado al uso de ensayos celulares in vitro y tejidos enteros o el aislamiento de tipos celulares específicos de animales para el análisis in vitro del transcriptoma y la expresión génica mediante la secuenciación de qPCR y ARN. El análisis exhaustivo del transcriptoma y la expresión génica de tipos específicos de células en tejidos y órganos complejos será fundamental para comprender los mecanismos celulares y moleculares mediante los cuales se regulan los genes y su asociación con la homeostasis tisular y el órgano Funciones. En este artículo, demostramos la metodología para el aislamiento del ARN ligado a ribosoma directamente in vivo en la endotelia vascular de los pulmones de animales como ejemplo. Se describirán los materiales y procedimientos específicos para el procesamiento de tejidos y la purificación del ARN, incluida la evaluación de la calidad y el rendimiento del ARN, así como el qPCR en tiempo real para ensayos genéticos arteriogénicos. Este enfoque, conocido como la técnica de traducción de la purificación de afinidad ribosoma (TRAP), se puede utilizar para la caracterización de la expresión génica y el análisis del transcriptoma de ciertos tipos de células directamente in vivo en cualquier tipo específico en tejidos complejos.
Introduction
En tejidos complejos como el cerebro, el corazón y el pulmón de los mamíferos, los altos niveles de heterogeneidad celular complican el análisis de los datos de expresión génica derivados de muestras de tejidos enteros. Para observar perfiles de expresión génica en un tipo de célula en particular in vivo, recientemente se ha desarrollado una nueva metodología, que permite el interrogatorio de todo el complemento de ARNm traducido de cualquier tipo de célula definida genéticamente. Esta metodología se conoce como la técnica de purificación de afinidad ribosoma de traducción (TRAP)1,2. Es una herramienta útil para estudiar la biología de las células endoteliales y la angiogénesis cuando se combina con la manipulación genética de otros genes asociados a la angiogénesis en animales.
Hemos demostrado que la señalización angiogénica PKD-1 y la transcripción del gen angiogénico CD36 son fundamentales para la diferenciación de células endoteliales (EC) y la angiogénesis funcional3,4,5,6. Para determinar los mecanismos moleculares de señalización angiogénica y metabólica en transcripción de genes y transdiferenciación EC, hemos creado ratones TRAP genéticamente diseñados con genes angiogénicos específicamente eliminados sobre la base de la técnica TRAP1 , 2. Además, en nuestros animales TRAP, no sólo tienen deficiencia de genes pkd-1 o cd36 en la endotelia vascular o deleción global del gen cd36, sino que una proteína de fluorescencia verde mejorada (EGFP) también está genéticamente etiquetada en La EC está traduciendo ribosomas. TRAP permite la purificación de afinidad de ARNm ligada a ribosomas directamente de la endotelia vascular de los tejidos específicos, lo que permite el análisis de la expresión génica y la identificación de nuevos transcriptomes asociados con la diferenciación de la CE y angiogénesis directamente en condiciones in vivo. Hemos aislado con éxito el ARN ligado al ribosoma de la endotelia en estos animales genéticamente diseñados. El ARN purificado se puede utilizar para una mayor caracterización de genes angiogénicos o arteriogénicos en la regulación de la diferenciación y las funciones de la CE. Este protocolo proporciona una guía paso a paso para implementar el enfoque TRAP para el aislamiento de arNM en los CE directamente in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
La angiogénesis es un complejo proceso de varios pasos, en el que la transcripción y expresión de genes angiogénicos específicos de la CE desempeñan un papel esencial en la diferenciación EC y la reprogramación angiogénica3,4. Para superar las barreras de la diversidad celular y la complejidad arquitectónica para comprender mejor la función del sistema vascular de mamíferos a nivel molecular in vivo, hemos creado ratones TRAP específicos de la CE, ac…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo del Dr. Ren es apoyado por la Asociación Americana del Corazón (13SDG14800019; BR), la Ann’s Hope Foundation (FP00011709; BR), la Sociedad Americana contra el Cáncer (86-004-26; el McW Cancer Center to BR), y el Instituto Nacional de Salud (HL136423; BR); Jordan Palmer cuenta con el apoyo del Programa de Pasantías MCW CTSI 500 Stars 2018; P. Moran cuenta con el apoyo de una Beca de Formación en Investigación Institucional de NHLBI (5T35 HL072483-34).
Materials
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer with Nanochips and Picochips | Agilent | G2939AA, 5067-1511 & 5067-1513 | |
| Cell scrapers | Sarstedt | 83.1832 | |
| Homogenizers | Fisher Scientific | K8855100020 | |
| Magnet (Dynamag-2) | Invitrogen | 123-21D | Will depend on purification scale; samples in 1.5-mL tubes can be concentrated on a DynaMag-2 |
| Minicentrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| NanoDrop 2000C spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000C | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5430R | with rotor for 1.5-mL microcentrifuge tubes |
| RNase-free 1.5mL microcentrifuge tubes | Applied Biosystems | AM12450 | |
| Rnase-free 50-mL conical tubes | Applied Biosystems | AM12501 | |
| RNase-free 1000-μl filter tips | Rainin | RT-1000F | |
| RNase-free 200-μl filter tips | Rainin | RT-200F | |
| RNase-free 20-μl filter tips | Rainin | RT-20F | |
| Rotor for homogenizers | Yamato | LT-400D | |
| Tube rotator, Labquake brand | Thermo Fisher | 13-687-12Q |
References
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).
- Zhou, P., et al. Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).
- Best, B., Moran, P., Ren, B. VEGF/PKD-1 signaling mediates arteriogenic gene expression and angiogenic responses in reversible human microvascular endothelial cells with extended lifespan. Molecular and Cellular Biochemistry. 446, 199-207 (2018).
- Ren, B., et al. LPA/PKD-1-FoxO1 Signaling Axis Mediates Endothelial Cell CD36 Transcriptional Repression and Proangiogenic and Proarteriogenic Reprogramming. Arteriosclerosclerosis Thrombosis, Vascular Biology. 36, 1197-1208 (2016).
- Ren, B. Protein Kinase D1 Signaling in Angiogenic Gene Expression and VEGF-Mediated Angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 37 (2016).
- Ren, B. FoxO1 transcriptional activities in VEGF expression and beyond: a key regulator in functional angiogenesis?. Journal of Pathology. 245, 255-257 (2018).
- Hupe, M., Li, M. X., Gertow Gillner, K., Adams, R. H., Stenman, J. M. Evaluation of TRAP-sequencing technology with a versatile conditional mouse model. Nucleic Acids Research. 42, e14 (2014).
- Dong, L., et al. Diet-induced obesity links to ER positive breast cancer progression via LPA/PKD-1-CD36 signaling-mediated microvascular remodeling. Oncotarget. 8, 22550-22562 (2017).
- Ren, B., et al. ERK1/2-Akt1 crosstalk regulates arteriogenesis in mice and zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 120, 1217-1228 (2010).
- Skuli, N., et al. Endothelial HIF-2alpha regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes. Journal of Clinical Investigation. 122, 1427-1443 (2012).
