Het vertalen van ribosome Affiniteits zuivering (TRAP) voor RNA-isolatie van endotheel cellen in vivo
Summary
We presenteren een aanpak om ribosome-gebonden mRNA van vasculaire endotheliale cellen (ECs) direct in muizenhersenen, Long-en hart weefsels te zuiveren via EC-specifieke genetische code van Enhanced Green fluorescentie proteïne (EGFP) in ribosomen in combinatie met RNA-zuivering .
Abstract
Veel studies zijn beperkt tot het gebruik van in vitro cellulaire testen en hele weefsels of isoleren van specifieke celtypen van dieren voor in vitro analyse van transcriptome en genexpressie door qPCR en RNA-sequencing. Uitgebreide transcriptome en genexpressie analyse van specifieke celtypen in complexe weefsels en organen zal van cruciaal belang zijn voor het begrijpen van cellulaire en moleculaire mechanismen waarmee genen gereguleerd worden en hun associatie met weefselhomeostase en orgaan Functies. In dit artikel, we demonstreren de methodologie voor isolatie van ribosome-gebonden RNA direct in vivo in de vasculaire endothelia van dierlijke longen als voorbeeld. De specifieke materialen en procedures voor weefsel verwerking en RNA-zuivering zullen worden beschreven, met inbegrip van de beoordeling van RNA-kwaliteit en opbrengst, evenals real-time qPCR voor arteriogenic gen-assays. Deze aanpak, bekend als het vertalen van ribosoom affiniteit zuivering (trap) techniek, kan worden gebruikt voor de karakterisering van genexpressie en transcriptome analyse van bepaalde celtypen rechtstreeks in vivo in een specifiek type in complexe weefsels.
Introduction
In complexe weefsels zoals het brein van zoogdieren, hart en longen, compliceren de hoge niveaus van cellulaire heterogeniteit de analyse van genexpressie gegevens afkomstig van hele weefselmonsters. Om genexpressie profielen in een bepaald celtype in vivo te observeren, is recentelijk een nieuwe methodologie ontwikkeld, die het mogelijk maakt de gehele vertaalde mRNA-aanvulling van elk genetisch gedefinieerd celtype te ondervragen. Deze methodologie staat bekend als de vertaling ribosoom affiniteit zuivering (trap) techniek1,2. Het is een nuttig hulpmiddel om endotheel celbiologie en angiogenese te bestuderen in combinatie met het genetisch manipuleren van andere angiogenese-geassocieerde genen bij dieren.
We hebben aangetoond dat angiogene PKD-1-signalering en de transcriptie van angiogene Gene CD36 essentieel zijn voor de differentiatie van endotheliale cellen (EC) en functionele angiogenese3,4,5,6. Om moleculaire mechanismen van angiogene en metabole signalering in gentranscriptie en EG-trans differentiatie te bepalen, hebben we genetisch gemanipuleerde VALMUIZEN gemaakt met specifiek verwijderde angiogene genen op basis van TRAP techniek1 , 2. Bovendien hebben ze in onze valdieren niet alleen PKD-1 of cd36 gen- deficiëntie in de vasculaire endothelia of globale deletie van cd36 gen, maar een versterkt groen fluorescentie proteïne (EGFP) is ook genetisch gelabeld op De door de EG te vertalen ribosomes. TRAP maakt affiniteits zuivering van ribosome-gebonden mRNA rechtstreeks uit de vasculaire endothelia van gerichte weefsels, waardoor de analyse van genexpressie en identificatie van nieuwe transcriptomes die geassocieerd zijn met EG-differentiatie en angiogenese direct onder in vivo condities. We hebben met succes geïsoleerd ribosome-gebonden RNA van de endothelia in deze genetisch gemanipuleerde dieren. Het gezuiverde RNA kan worden gebruikt voor verdere karakterisering van angiogene of arteriogene genen in de regulatie van EG-differentiatie en-functies. Dit protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor het implementeren van de TRAP-aanpak voor de isolatie van mRNA in ECs rechtstreeks in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Angiogenese is een complex meerstaps proces, waarin EC-specifieke angiogene gentranscriptie en expressie een essentiële rol spelen in EG-differentiatie en angiogene herprogrammering3,4. Om de barrières van de cellulaire diversiteit en architecturale complexiteit te overwinnen voor een beter begrip van de functie van het zoogdier vasculaire systeem op moleculair niveau in vivo, hebben we EC-specifieke VALMUIZEN gecreëerd, vergezeld van EC-specifieke cd36 </…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het werk van Dr ren wordt ondersteund door de American Heart Association (13SDG14800019; BR), de Stichting van de Ann’s Hope (FP00011709; BR), de American Cancer Society (86-004-26; het MCW Cancer Center to BR) en het National Institute of Health (HL136423; BR); Jordan Palmer wordt ondersteund door het 2018 MCW CTSI 500 Stars Internship Program; P. Moran wordt ondersteund door een institutionele onderzoeksopleiding subsidie van NHLBI (5T35 HL072483-34).
Materials
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer with Nanochips and Picochips | Agilent | G2939AA, 5067-1511 & 5067-1513 | |
| Cell scrapers | Sarstedt | 83.1832 | |
| Homogenizers | Fisher Scientific | K8855100020 | |
| Magnet (Dynamag-2) | Invitrogen | 123-21D | Will depend on purification scale; samples in 1.5-mL tubes can be concentrated on a DynaMag-2 |
| Minicentrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| NanoDrop 2000C spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000C | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5430R | with rotor for 1.5-mL microcentrifuge tubes |
| RNase-free 1.5mL microcentrifuge tubes | Applied Biosystems | AM12450 | |
| Rnase-free 50-mL conical tubes | Applied Biosystems | AM12501 | |
| RNase-free 1000-μl filter tips | Rainin | RT-1000F | |
| RNase-free 200-μl filter tips | Rainin | RT-200F | |
| RNase-free 20-μl filter tips | Rainin | RT-20F | |
| Rotor for homogenizers | Yamato | LT-400D | |
| Tube rotator, Labquake brand | Thermo Fisher | 13-687-12Q |
References
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).
- Zhou, P., et al. Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).
- Best, B., Moran, P., Ren, B. VEGF/PKD-1 signaling mediates arteriogenic gene expression and angiogenic responses in reversible human microvascular endothelial cells with extended lifespan. Molecular and Cellular Biochemistry. 446, 199-207 (2018).
- Ren, B., et al. LPA/PKD-1-FoxO1 Signaling Axis Mediates Endothelial Cell CD36 Transcriptional Repression and Proangiogenic and Proarteriogenic Reprogramming. Arteriosclerosclerosis Thrombosis, Vascular Biology. 36, 1197-1208 (2016).
- Ren, B. Protein Kinase D1 Signaling in Angiogenic Gene Expression and VEGF-Mediated Angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 37 (2016).
- Ren, B. FoxO1 transcriptional activities in VEGF expression and beyond: a key regulator in functional angiogenesis?. Journal of Pathology. 245, 255-257 (2018).
- Hupe, M., Li, M. X., Gertow Gillner, K., Adams, R. H., Stenman, J. M. Evaluation of TRAP-sequencing technology with a versatile conditional mouse model. Nucleic Acids Research. 42, e14 (2014).
- Dong, L., et al. Diet-induced obesity links to ER positive breast cancer progression via LPA/PKD-1-CD36 signaling-mediated microvascular remodeling. Oncotarget. 8, 22550-22562 (2017).
- Ren, B., et al. ERK1/2-Akt1 crosstalk regulates arteriogenesis in mice and zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 120, 1217-1228 (2010).
- Skuli, N., et al. Endothelial HIF-2alpha regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes. Journal of Clinical Investigation. 122, 1427-1443 (2012).
