Summary

Übersetzen von Ribososomen-Affinitätsreinigung (TRAP) zur RNA-Isolierung von Endothelzellen In vivo

Published: May 25, 2019
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Summary

Wir präsentieren einen Ansatz zur Reinigung ribossomengebundener mRNA aus vaskulären Endothelzellen (ECs) direkt im Gehirn, der Lunge und im Herzgewebe der Maus über das EC-spezifische genetische Tag des verbesserten grünen Fluoreszenzproteins (EGFP) in Ribosomen in Kombination mit RNA-Reinigung .

Abstract

Viele Studien beschränkten sich auf die Verwendung von in vitro zellulären Assays und ganzen Geweben oder die Isolierung bestimmter Zelltypen von Tieren zur In-vitro-Analyse von Transkriptom und Genexpression durch qPCR- und RNA-Sequenzierung. Umfassende Transkriptom- und Genexpressionsanalyse spezifischer Zelltypen in komplexen Geweben und Organen wird entscheidend sein, um zelluläre und molekulare Mechanismen zu verstehen, durch die Gene reguliert werden, und ihre Assoziation mit Gewebehomöostase und Organ Funktionen. In diesem Artikel zeigen wir als Beispiel die Methodik zur Isolierung ribosomgebundener RNA direkt in vivo in der vaskulären Endothelie der Tierlunge. Die spezifischen Materialien und Verfahren für die Gewebeverarbeitung und RNA-Reinigung werden beschrieben, einschließlich der Bewertung der RNA-Qualität und -Ausbeute sowie der Echtzeit-qPCR für arteriogene Gen-Assays. Dieser Ansatz, der als Übersetzung der Ribosomen-Affinitätsreinigung (TRAP)-Technik bekannt ist, kann zur Charakterisierung der Genexpression und Transkriptomanalyse bestimmter Zelltypen direkt in vivo in jedem spezifischen Typ in komplexen Geweben verwendet werden.

Introduction

In komplexen Geweben wie Gehirn, Herz und Lunge erschweren die hohen Zellheterogenitätdien die Analyse von Genexpressionsdaten aus ganzen Gewebeproben. Um Genexpressionsprofile in einem bestimmten Zelltyp in vivo zu beobachten, wurde kürzlich eine neue Methodik entwickelt, die die Abfrage der gesamten übersetzten mRNA-Ergänzung eines genetisch definierten Zelltyps ermöglicht. Diese Methode wird als die übersetzende Ribosome Affinitätsreinigung (TRAP) Technik1,2bekannt. Es ist ein nützliches Werkzeug, um Endothelzellbiologie und Angiogenese in Kombination mit genetisch manipulierender anderer Angiogenese-assoziierter Gene bei Tieren zu untersuchen.

Wir haben gezeigt, dass angiogene PKD-1-Signalisierung und die Transkription des angiogenen Gens CD36 für die Endothelzelldifferenzierung (EC) und funktionelle Angiogenese3,4,5,6entscheidend sind. Um molekulare Mechanismen der angiogenen und metabolischen Signalisierung in der Gentranskription und der EG-Transdifferenzierung zu bestimmen, haben wir gentechnisch veränderte TRAP-Mäuse mit speziell gelöschten angiogenen Genen auf der Grundlage der TRAP-Technik1 erstellt. , 2. Darüber hinaus haben sie bei unseren TRAP-Tieren nicht nur pkd-1- oder cd36-Genmangel in der vaskulären Endothelie oder die globale Deletion des cd36-Gens, sondern ein verbessertes grünes Fluoreszenzprotein (EGFP) ist auch genetisch auf Die übersetzenden Ribosomen der EG. TRAP ermöglicht die Affinitätsreinigung von ribosomgebundener mRNA direkt aus der vaskulären Endothelie von Zielgeweben, was die Analyse der Genexpression und die Identifizierung neuer Transkriptome ermöglicht, die mit der EG-Differenzierung und Angiogenese direkt unter in vivo-Bedingungen. Wir haben bei diesen gentechnisch veränderten Tieren erfolgreich ribosomgebundene RNA aus der Endothelie isoliert. Die gereinigte RNA kann zur weiteren Charakterisierung angiogener oder arteriogener Gene bei der Regulation von EG-Differenzierung und -Funktionen verwendet werden. Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Implementierung des TRAP-Ansatzes zur Isolierung von mRNA in ECs direkt in vivo.

Protocol

Für Tierversuche wurden alle hier beschriebenen Methoden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Medical College of Wisconsin genehmigt. 1. Reagenzien vorbereiten Bereiten Sie Lysepuffer auf Konzentrationen von 10 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT, 100 mg/ml Cycloheximid, Proteaseinhibitoren und rekombinanten RNase-Inhibitoren auf Konzentrationen wie unten beschrieben vor. Folgende Reagenzien zu 500 ml RNase-freiem deionisiertem Wass…

Representative Results

Unsere früheren Studien4,7 deuten darauf hin, dass CD36 als Schalter für arteriolar Differenzierung und Kapillararterienarterienbildung über den LPA/PKD-1 Signalweg fungieren kann. Um zu untersuchen, ob die Signalachse LPA/PKD-1-CD36 für die Arteriogenese in vivo wesentlich ist, haben wir die neuartigen TRAP-Linien etabliert, die nicht nur einen globalen cd36-Mangel oder einen endothelialen-spezifischen-cd36- oder pkd-1-Mangel haben, sondern auch eine selekti…

Discussion

Die Angiogenese ist ein komplexer mehrstufiger Prozess, bei dem DIE EC-spezifische angiogene Gentranskription und -expression eine wesentliche Rolle bei der EG-Differenzierung und angiogenen Reprogrammierung3,4spielen. Um die Barrieren aus der zellulären Vielfalt und architektonischen Komplexität zu überwinden, um die Funktion des Säugetiergefäßsystems auf molekularer Ebene in vivo besser zu verstehen, haben wir EC-spezifische TRAP-Mäuse geschaffen, beglei…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dr. Rens Arbeit wird von der American Heart Association (13SDG14800019; BR), der Ann es Hope Foundation (FP00011709; BR), die American Cancer Society (86-004-26; das MCW Cancer Center to BR) und das National Institute of Health (HL136423; BR); Jordan Palmer wird vom MCW CTSI 500 Stars Internship Program 2018 unterstützt; P. Moran wird von einem Institutional Research Training Grant von NHLBI (5T35 HL072483-34) unterstützt.

Materials

2100 Electrophoresis Bioanalyzer with Nanochips and Picochips Agilent G2939AA, 5067-1511 & 5067-1513
Cell scrapers Sarstedt 83.1832
Homogenizers Fisher Scientific K8855100020
Magnet (Dynamag-2) Invitrogen 123-21D Will depend on purification scale; samples in 1.5-mL tubes can be concentrated on a DynaMag-2
Minicentrifuge Fisher Scientific 05-090-100
NanoDrop 2000C spectrophotometer Thermo Scientific  ND-2000C
Refrigerated centrifuge Eppendorf 5430R with rotor for 1.5-mL microcentrifuge tubes
RNase-free 1.5mL microcentrifuge tubes Applied Biosystems  AM12450
Rnase-free 50-mL conical tubes Applied Biosystems  AM12501
RNase-free 1000-μl filter tips Rainin RT-1000F
RNase-free 200-μl filter tips Rainin  RT-200F
RNase-free 20-μl filter tips Rainin  RT-20F
Rotor for homogenizers Yamato  LT-400D
Tube rotator, Labquake brand Thermo Fisher 13-687-12Q

References

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Cite This Article
Moran, P., Guo, Y., Yuan, R., Barnekow, N., Palmer, J., Beck, A., Ren, B. Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo. J. Vis. Exp. (147), e59624, doi:10.3791/59624 (2019).

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