Перевод Рибосома Сроднистого Очищения (TRAP) для изоляции РНК от эндотелиальных клеток In vivo
Summary
Мы представляем подход к очищению рибосомы связанных мРНК от сосудистых эндотелиальных клеток (ECs) непосредственно в мозге мыши, легких и тканей сердца через EC-специфический генетический тег расширенного зеленого белка флуоресценции (EGFP) в рибосомы в сочетании с РНК очистки .
Abstract
Многие исследования были ограничены использованием in vitro клеточных анализов и целых тканей или изоляции конкретных типов клеток от животных для анализа в пробирке транскриптома и экспрессии генов qPCR и секвенирования РНК. Всеобъемлющий анализ транскриптома и экспрессии генов конкретных типов клеток в сложных тканях и органах будет иметь решающее значение для понимания клеточных и молекулярных механизмов, с помощью которых регулируются гены, и их связь с гомеостазом тканей и органов Функции. В этой статье мы демонстрируем методологию изоляции рибосомной РНК непосредственно в виво в сосудистой эндофилии легких животных в качестве примера. Будут описаны конкретные материалы и процедуры для обработки тканей и очистки РНК, включая оценку качества и урожайности РНК, а также в режиме реального времени qPCR для атериогенных анализов генов. Этот подход, известный как перевод рибосомы сродства очистки (TRAP) техники, могут быть использованы для характеристики экспрессии генов и транскриптома анализа некоторых типов клеток непосредственно in vivo в любом конкретном типе в сложных тканях.
Introduction
В сложных тканях, таких как мозг млекопитающих, сердце и легкие, высокий уровень клеточной неоднородности усложняет анализ данных экспрессии генов, полученных из образцов целых тканей. Для наблюдения за профилями экспрессии генов в определенном типе клеток in vivo недавно была разработана новая методология, которая позволяет дополнить весь переведенный мРНК любого генетически определенного типа клеток. Эта методология известна как перевод рибосомы сродства очистки (TRAP) техника1,2. Это полезный инструмент для изучения эндотелиальной клеточной биологии и ангиогенеза в сочетании с генетически манипулирования другими ангиогенез-связанных генов у животных.
Мы показали, что ангиогенные PKD-1 сигнализации и транскрипции ангиогенного гена CD36 имеют решающее значение для эндотелиальной клеточной (EC) дифференциации и функционального ангиогенеза3,4,5,6. Для определения молекулярных механизмов ангиогенной и метаболической сигнализации в транскрипции генов и трансдифференцации ЕС мы создали генетически модифицированных тэктмы с специально удаленными ангиогенными генами на основе метода TRAP1 , 2. Кроме того, у наших животных TRAP, не только они имеют pkd-1 или cd36 дефицит генов в сосудистой эндактелии или глобального удаления гена CD36, но расширенный зеленый белок флуоресценции (EGFP) также генетически помечены на ЕК переводит рибосомы. TRAP позволяет очистки сродства рибосомы связаны мРНК непосредственно из сосудистой эндофелии целевых тканей, что позволяет анализ экспрессии генов и идентификации новых транскриптомов, которые связаны с дифференциацией ЕС и ангиогенез непосредственно под in vivo условиях. Мы успешно выделили рибосомную РНК из эндотелии у этих генетически модифицированных животных. Очищенная РНК может быть использована для дальнейшей характеристики ангиогенных или артериогенных генов в регуляции дифференциации и функций ЕС. Этот протокол представляет собой пошаговое руководство по внедрению подхода TRAP для изоляции мРНК в ECs непосредственно in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ангиогенез представляет собой сложный многоступенчатый процесс, в котором EC-специфической ангиогенной транскрипции генов и экспрессии играют важную роль в дифференциации ЕС и ангиогенного перепрограммирования3,4. Чтобы преодолеть барьеры от клеточног…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа д-ра Рена поддерживается Американской ассоциацией сердца (13SDG148800019; BR), Фонд Надежды Анны (FP00011709; BR), Американское онкологическое общество (86-004-26; MCW онкологический центр в БР), и Национальный институт здравоохранения (HL136423; BR); Джордан Палмер поддерживается 2018 MCW CTSI 500 Звезды стажировки программы; . Моран поддерживается институциональным исследовательским грантом от NHLBI (5T35 HL072483-34).
Materials
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer with Nanochips and Picochips | Agilent | G2939AA, 5067-1511 & 5067-1513 | |
| Cell scrapers | Sarstedt | 83.1832 | |
| Homogenizers | Fisher Scientific | K8855100020 | |
| Magnet (Dynamag-2) | Invitrogen | 123-21D | Will depend on purification scale; samples in 1.5-mL tubes can be concentrated on a DynaMag-2 |
| Minicentrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| NanoDrop 2000C spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000C | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5430R | with rotor for 1.5-mL microcentrifuge tubes |
| RNase-free 1.5mL microcentrifuge tubes | Applied Biosystems | AM12450 | |
| Rnase-free 50-mL conical tubes | Applied Biosystems | AM12501 | |
| RNase-free 1000-μl filter tips | Rainin | RT-1000F | |
| RNase-free 200-μl filter tips | Rainin | RT-200F | |
| RNase-free 20-μl filter tips | Rainin | RT-20F | |
| Rotor for homogenizers | Yamato | LT-400D | |
| Tube rotator, Labquake brand | Thermo Fisher | 13-687-12Q |
References
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).
- Zhou, P., et al. Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).
- Best, B., Moran, P., Ren, B. VEGF/PKD-1 signaling mediates arteriogenic gene expression and angiogenic responses in reversible human microvascular endothelial cells with extended lifespan. Molecular and Cellular Biochemistry. 446, 199-207 (2018).
- Ren, B., et al. LPA/PKD-1-FoxO1 Signaling Axis Mediates Endothelial Cell CD36 Transcriptional Repression and Proangiogenic and Proarteriogenic Reprogramming. Arteriosclerosclerosis Thrombosis, Vascular Biology. 36, 1197-1208 (2016).
- Ren, B. Protein Kinase D1 Signaling in Angiogenic Gene Expression and VEGF-Mediated Angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 37 (2016).
- Ren, B. FoxO1 transcriptional activities in VEGF expression and beyond: a key regulator in functional angiogenesis?. Journal of Pathology. 245, 255-257 (2018).
- Hupe, M., Li, M. X., Gertow Gillner, K., Adams, R. H., Stenman, J. M. Evaluation of TRAP-sequencing technology with a versatile conditional mouse model. Nucleic Acids Research. 42, e14 (2014).
- Dong, L., et al. Diet-induced obesity links to ER positive breast cancer progression via LPA/PKD-1-CD36 signaling-mediated microvascular remodeling. Oncotarget. 8, 22550-22562 (2017).
- Ren, B., et al. ERK1/2-Akt1 crosstalk regulates arteriogenesis in mice and zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 120, 1217-1228 (2010).
- Skuli, N., et al. Endothelial HIF-2alpha regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes. Journal of Clinical Investigation. 122, 1427-1443 (2012).
