Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Daniel Some; Hadar Amartely; Ayala Tsadok; Mario Lebendiker

doi:10.3791/59615

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biochemistry

Caractérisation des protéines par chromatographie d'exclusion couplée à multi-angle Light Scattering (SEC-MALS)

Published: June 20, 2019

doi:

10.3791/59615

Daniel Some¹, Hadar Amartely², Ayala Tsadok³, Mario Lebendiker²

¹Wyatt Technology Corporation, ²Wolfson Centre for Applied Structural Biology, The Alexander Silberman Institute of Life Science,The Hebrew University of Jerusalem, ³Danyel Biotech Ltd.

Summary

Ce protocole décrit la combinaison de la chromatographie d’exclusion de taille avec la diffusion de lumière multi-angle (SEC-MALS) pour la caractérisation absolue des protéines et des complexes dans la solution. SEC-MALS détermine le poids moléculaire et la taille des protéines pures, des oligomères indigènes, des hétérocomplexes et des protéines modifiées telles que les glycoprotéines.

Abstract

La chromatographie analytique d’exclusion de taille (SEC), couramment utilisée pour déterminer le poids moléculaire des protéines et des complexes protéines-protéines en solution, est une technique relative qui repose sur le volume d’élution de l’analyte pour estimer les poids. Lorsque la protéine n’est pas globulaire ou subit des interactions de colonne non idéales, la courbe d’étalonnage basée sur les normes de protéines est invalide, et le poids moléculaire déterminé à partir du volume d’élution est incorrect. La diffusion de la lumière multi-angle (MALS) est une technique absolue qui détermine le poids moléculaire d’un analyte dans la solution à partir d’équations physiques de base. La combinaison de SEC pour la séparation avec MALS pour l’analyse constitue un moyen polyvalent et fiable pour caractériser les solutions d’une ou plusieurs espèces protéiques, y compris les monomères, oligomères indigènes ou agrégats, et les hétérocomplexes. Étant donné que la mesure est effectuée à chaque volume d’élution, SEC-MALS peut déterminer si un pic d’élution est homogène ou hétérogène et faire la distinction entre une répartition du poids moléculaire fixe par rapport à l’équilibre dynamique. L’analyse de protéines modifiées telles que les glycoprotéines ou les lipoprotéines, ou des conjugués tels que les protéines membranaires détergent-solubilisées, est également possible. Par conséquent, SEC-MALS est un outil essentiel pour le chimiste de protéine qui doit confirmer les propriétés biophysiques et le comportement de solution des molécules produites pour la recherche biologique ou biotechnologique. Ce protocole pour SEC-MALS analyse le poids moléculaire et la taille des monomères et des agrégats de protéines pures. Les données acquises servent de base à d’autres analyses SEC-MALS, y compris celles de complexes, de glycoprotéines et de protéines membranaires liées aux surfactants.

Introduction

Une analyse fiable du poids moléculaire (MW) des protéines en solution est essentielle pour la recherche biomoléculaire¹^,²^,³^,⁴. L’analyse de MW informe le scientifique si la protéine correcte a été produite et si elle est appropriée pour l’usage dans l’expérimentation plus loin⁵^,⁶. Comme décrit sur les sites Web des réseaux de recherche sur les protéines P4EU⁷ et ARBRE-Mobieu⁸, le contrôle de la qualité des protéines doit caractériser non seulement la pureté du produit final, mais aussi son état oligomérique, son homogénéité, son identité, sa conformation, structure, les modifications post-traduction et d’autres propriétés.

La mesure MW dans la solution non dénaturante identifie la forme de la protéine qui est présente dans un environnement aqueux, qu’il soit monomérique ou oligomérique. Alors que pour de nombreuses protéines l’objectif est de produire la forme monomérique, pour d’autres un oligomère indigène spécifique est la clé de l’activité biologique⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹². D’autres oligomères et agrégats non indigènes ne sont pas souhaitables et entraîneront des défauts dans la détermination structurelle par la cristallographie, la résonance magnétique nucléaire (RMN) ou la diffusion de rayons X à petit angle, ainsi que des artefacts ou des inexactitudes dans les analyses fonctionnelles quantifier la liaison par calorimétrie de titration isothermique ou résonance plasmon de surface²^,¹³.

Dans le cas des biothérapeutiques tels que les anticorps monoclonaux (mAbs), l’analyse MW basée sur des solutions sert un but similaire de contrôle de la qualité et de caractérisation du produit. Les agrégats et les fragments excessifs sont indicatifs d’un produit instable qui n’est pas adapté à une utilisation humaine. Les organismes de réglementation exigent une caractérisation minutieuse, non seulement de la molécule thérapeutique, mais aussi des dégradants potentiels qui peuvent être présents dans le produit final¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷.

Certaines des méthodes les plus répandues pour analyser les protéines MW sont l’électrophores de gel de sulfate de sulfate de sodium polyacrylamide (SDS-PAGE), l’électrophorèse capillaire (CE), la PAGE indigène, la spectrométrie de masse (MS), la chromatographie d’exclusion de taille (SEC) et l’analyse l’ultracentrifugation (AUC). Parmi ceux-ci, SDS-PAGE, CE et MS ne sont pas exécutés dans l’état indigène et conduisent généralement à la dissociation des oligomères et des agrégats, donc ne sont pas appropriés pour déterminer l’oligomère indigène ou quantifier les agrégats. Bien que page indigène ne, théoriquement, conserver l’état natif, dans notre expérience, il est difficile d’optimiser pour de nombreuses protéines, et les résultats ne sont pas très fiables. L’AUC, que ce soit par vitesse de sédimentation ou équilibre de sédimentation, est quantitative et peut déterminer MW à partir des premiers principes, mais il est assez lourd, nécessitant beaucoup de travail manuel et une expertise significative dans l’interprétation des données, le temps d’expérience long et un instrument très coûteux.

La SEC analytique est une méthode quantitative et relativement robuste et simple qui sépare les macromolécules pendant le flux à travers une colonne emballée. Les principes et les applications de la SEC sont bien présentés dans plusieurs revues¹⁸^,¹⁹^,²⁰ et dans le manuel “Size Exclusion Chromatography: Principles and Methods”²¹. Les différences de rétention sont dues à différentes quantités de temps passé à se répandre dans et hors des pores dans la phase stationnaire avant d’élavoir de la fin de la colonne. Les différences proviennent (nominalement) des tailles relatives et des coefficients de diffusion des molécules²². Une courbe d’étalonnage est construite à l’aide d’une série de molécules de référence, reliant le MW de la molécule au volume d’élution. Pour les protéines, les molécules de référence sont généralement des protéines globulaires bien élevées qui n’interagissent pas avec la colonne par charge ou résidus de surface hydrophobes. Le volume d’élution est mesuré à l’aide d’un détecteur d’absorption ultraviolet (UV). Si le coefficient d’extinction UV est connu- souvent calculé à partir de la séquence, la masse totale maximale de protéines peut également être quantite.

Notamment, l’analyse de MW par SEC repose sur deux hypothèses clés concernant les protéines à caractériser : 1) elles partagent avec les normes de référence la même conformation et le même volume spécifique (en d’autres termes, la même relation entre les propriétés de diffusion et MW) et 2) comme les normes de référence, ils n’interagissent pas avec la colonne, sauf par des propriétés stériques, ils n’adhèrent pas à l’emballage de la colonne par charge ou interactions hydrophobes. Les déviations par rapport à ces hypothèses invalident la courbe d’étalonnage et conduisent à des déterminations erronées du MW. C’est le cas pour les protéines intrinsèquement désordonnées qui ont de grands radii de Stokes en raison de leurs régions non structurées étendues²³^,²⁴ ou non sphériques/linéaires assemblages oligomeric¹⁰. Les protéines glycosylated auront généralement un plus grand rayon de Stokes que la forme non-glycosylated, même quand la masse ajoutée de hydrate de carbone est prise en compte¹⁹. Les protéines membranaires stétrifiantes s’élifient différemment des protéines d’étalonnage parce que leur suppression de sec dépend de la taille totale du complexe polypeptide-détergent-lipides plutôt que de l’état oligomeric et de la masse molaire de la protéine²⁵ ^,²⁶. La chimie des colonnes, le pH et les conditions de sel affectent tous les volumes d’élution des protéines avec des résidus de surface chargés ou hydrophobes²⁷^,²⁸.

SEC devient beaucoup plus polyvalent et fiable pour la détermination MW lorsqu’il est combiné avec la diffusion de lumière multi-angle (MALS) et différentiel réfractive index (dRI) détecteurs³^,⁴^,¹¹^,²⁹^, ³⁰^,³¹^,³². Un détecteur d’IRD détermine la concentration en fonction de la variation de l’indice de réfraction de la solution en raison de la présence de l’analyte. Un détecteur MALS mesure la proportion de lumière dispersée par un analyte en plusieurs angles par rapport au faisceau laser incident. Collectivement connu sous le nom SEC-MALS, cet instrumentation détermine MW indépendamment du temps d’élution puisque MW peut être calculé directement à partir des premiers principes en utilisant l’équation 1,

①

où M est le poids moléculaire de l’analyte, R(0) le rapport réduit de Rayleigh (c.-à-d., la quantité de lumière dispersée par l’analyte par rapport à l’intensité laser) déterminée par le détecteur MALS et extrapolée à l’angle zéro, c concentration de poids déterminée par le détecteur UV ou dRI, dn/dc l’incrément de l’indice de réfraction de l’analyte (essentiellement la différence entre l’indice de réfraction de l’analyte et le tampon), et K une constante optique qui dépend de la propriétés du système telles que la longueur d’onde et l’indice de réfraction des solvants²⁹.

Dans SEC-MALS, la colonne SEC est utilisée uniquement pour séparer les différentes espèces en solution afin qu’elles pénètrent individuellement dans les cellules du MALS et du détecteur de concentration. Le temps de rétention réel n’a aucune signification pour l’analyse, sauf dans la mesure où il résout les espèces protéiques. Les instruments sont calibrés indépendamment de la colonne et ne reposent pas sur des normes de référence. Par conséquent, SEC-MALS est considéré comme une méthode «absolue» pour la détermination MW à partir d’équations physiques de base. Si l’échantillon est hétérogène et non complètement séparé par la colonne, alors la valeur fournie à chaque volume d’élution sera une moyenne de poids des molécules dans chaque volume d’élution qui circule à travers la cellule d’écoulement par tranche de temps, environ 75 L.

En anadisant la variation angulaire de l’intensité de diffusion, MALS peut également déterminer la taille (rayon carré racine-moyen, R_g) des macromolécules et des nanoparticules avec un rayon géométrique supérieur à environ 12,5 nm²⁹. Pour les espèces plus petites comme les protéines monomériques et les oligomères, un module dynamique de diffusion de la lumière (DLS) peut être ajouté à l’instrument MALS afin de mesurer les radii hydrodynamiques à partir de 0,5 nm et jusqu’à³³.

Bien que l’analyse de la concentration des UV ou de l’IRD puisse fournir la valeur de c dans l’Eq. 1, l’utilisation de l’IRD est préférable pour deux raisons : 1) dRI est un détecteur de concentration universel, adapté à l’analyse de molécules telles que les sucres ou les polysaccharides qui ne contiennent pas d’UV chromophore³⁴; et 2) la réponse de concentration dn/dc de presque toutes les protéines pures dans le tampon aqueux est la même à dans un ou deux pour cent (0.185 mL/g)^35,ainsi il n’est pas nécessaire de connaître le coefficient d’extinction UV.

L’utilisation de SEC-MALS dans la recherche sur les protéines est assez étendue. De loin les applications les plus courantes sont d’établir si une protéine purifiée est monomeric ou oligomeric et le degré d’oligomerisation, et l’évaluation des agrégats³^,¹⁰^,¹¹^,¹⁷^, ³¹^,³⁶^,³⁷^,³⁸. La capacité de le faire pour les protéines membranaires détergent-solubilisées qui ne peuvent pas être caractérisées par des moyens traditionnels est particulièrement prisée, et des protocoles détaillés pour ceci ont été édités³¹^,³⁹^,⁴⁰ ^, ⁴¹ Ans, états-unis ( ^, ⁴² Ans, états-unis ( ^, ⁴³. D’autres applications courantes comprennent l’établissement du degré de modification post-traduction nacrée et de polydispersity de la glycoprotéine, des lipoprotéines et des conjugues similaires⁴^,³¹^,⁴⁴ ^, ⁴⁵ Annonces ^, ^{46 Annonces} ^, ⁴⁷; la formation (ou l’absence de celle-ci) et la stoichiométrie absolue (par opposition au rapport stoichiométrique) des hétérocomplexes, y compris les protéines-protéines, l’acide nucléique-protéine et les complexes protéique-polysaccharide²⁴^,⁴⁶^, ⁴⁸^,⁴⁹^,⁵⁰^,⁵¹^,⁵²; déterminer la dissociation d’équilibre monomère-dimer constante⁴⁹^,⁵³^,⁵⁴; et l’évaluation de la conformation des protéines⁵⁵^,⁵⁶. Au-delà des protéines, SEC-MALS est inestimable pour la caractérisation des peptides⁵⁷^,⁵⁸, polymères naturels largement hétérogènes tels que les héparines⁵⁹ et chitosans⁶⁰^,⁶¹, petits virus⁶² et la plupart des types de polymères synthétiques ou transformés⁶³^,⁶⁴^,⁶⁵^,⁶⁶. Une bibliographie étendue peut être trouvée dans la littérature⁶⁷ et en ligne (à http://www.wyatt.com/bibliography).

Ici, nous présentons un protocole standard pour l’exécution et l’analyse d’une expérience SEC-MALS. L’albumine bovine de sérum (BSA) est présentée comme exemple pour la séparation et la caractérisation des monomères et des oligomères de protéine. Le protocole BSA détermine certaines constantes du système qui servent de base à d’autres analyses SEC-MALS, y compris celles des complexes, des glycoprotéines et des protéines membranaires liées aux surfactants.

Nous notons que SEC-MALS peut être effectué en utilisant la chromatographie liquide haute performance standard (HPLC) ou l’équipement de chromatographie liquide à protéines rapides (FPLC) de nombreux fournisseurs. Ce protocole décrit l’utilisation d’un système FPLC que l’on trouve couramment dans les laboratoires qui produisent des protéines pour la recherche et le développement (voir Tableau des matériaux). Avant d’exécuter le protocole, le système FPLC, les détecteurs MALS et dRI auraient dû être installés, ainsi que leurs progiciels respectifs pour le contrôle, l’acquisition et l’analyse de données selon les instructions des fabricants et les constantes d’étalonnage requises. ou d’autres paramètres entrés dans le logiciel. Un filtre en ligne doit être placé entre la pompe et l’injecteur avec une membrane hydrophile de 0,1 m pore installée.

Protocol

1. Préparation du système Connectez les détecteurs MALS et dRI en aval du détecteur UV du FPLC. Détournent le pH et les détecteurs de conductivité puisqu’ils ajouteront un volume interdétecteur important entre les détecteurs UV et MALS. Utilisez des tubes capillaires de 0,25 mm i.d. de la colonne à et entre les détecteurs, et 0,75 mm i.d. tubes capillaires sur la sortie des détecteurs à déchets ou collecteur de fractions. Assurez-vous que les connexions de signal nécessaires entre le FPLC et les détecteurs ont été établies, y compris la sortie analogique du détecteur UV à l’entrée analogique MALS, et la sortie numérique du FPLC à l’auto-inject de MALS, via la boîte I/O du FPLC. Installez une colonne SEC analytique appropriée couvrant une plage de fractionnement d’au moins 20 kDa à 500 kDa. Vérifiez les informations sur le produit pour déterminer si la colonne convient à la gamme de MW, pH et autres propriétés de l’échantillon et de la phase mobile. 2. Préparation de tampon, f lushing le système pendant la nuit et vérifier la propreté À l’aide de réactifs de qualité HPLC, préparer 1 L de saline tamponnée de phosphate avec 50 à 100 mM NaCl. Filtrer le tampon à 0,1 m à l’aide d’un filtre à sulfure en polyéthylisme en bouteille ou similaire. Filtrer les 50-100 premiers ml de tampon dans une bouteille de déchets et jeter, afin d’éliminer les particules des filtres secs, puis filtrer le reste à une bouteille propre et stérile qui a été lavé à fond avec de l’eau filtrée et désionisée et plafonné pour prévenir poussière d’entrer.REMARQUE : D’autres solvants de phase mobiles tels qu’un tampon Tris peuvent être utilisés si des protéines supplémentaires qui sont dissoutes de préférence dans ces solvants doivent être analysées. Rincer la nuit à un débit de 0,5 ml/min, ou comme le recommande le fabricant de la colonne, pour réquiller la colonne dans le tampon et enlever les particules. Utilisez le mode flux continu du FPLC et assurez-vous que le flux ne s’arrête pas tant que toutes les exécutions SEC-MALS ne sont pas terminées. Placez la cellule d’écoulement dRI en mode Purge pendant la chasse d’eau pendant la nuit. Éteignez la purge avant de commencer l’exécution de l’échantillon. Au début de la chasse d’eau, augmentez graduellement le débit pour éviter l’effet de « rejet de colonne » (ou la libération de particules) causé par un changement soudain de pression dans la colonne. Si le système est connu pour être assez stable et sans particules, et en équilibre avec la phase mobile souhaitée, remplacez la chasse d’eau de nuit par une chasse d’eau plus courte de 2 à 3 h. Vérifier la propreté du système en tapant légèrement le tube en aval de la colonne pour libérer les particules accumulées et en observant le signal dans le détecteur à 90 degrés sur l’écran avant de l’instrument MALS. Vérifiez que le bruit de pointe à pic n’est pas supérieur à 50 -100 V. Effectuez une injection « vierge » pour vérifier que l’injecteur est propre aux particules. Un « blanc » est simplement le tampon en cours d’exécution, préparé dans une fiole fraîche et stérile. Si le pic de particules n’est pas supérieur à 1 ml de volume et ne dépasse pas 5 mV au-dessus de la ligne de base, le système est prêt pour les échantillons. Sinon, effectuez des injections blanches supplémentaires jusqu’à ce qu’elles soient propres, ou effectuez l’entretien pour nettoyer l’injecteur. 3. Préparation et chargement de l’échantillon Préparer au moins 200 l de BSA à 1-2 mg/mL dans le tampon SEC.REMARQUE : Afin d’éviter les précipitations, la BSA ne doit jamais être dissoute dans l’eau pure. Filtrer la protéine à 0,02 m à l’aide d’un filtre à pointe de seringue. Jetez les premières gouttes de filtrate afin d’éliminer les particules des filtres secs. Alternativement, centrifuger l’échantillon à 10.000 x g pendant 15 min pour permettre la précipitation des agrégats non solubles et d’autres grosses particules. Injecter 100 l de la solution BSA dans la boucle.REMARQUE : Il s’agit de la quantité recommandée de matériel, et plus ou moins peut être injecté selon les circonstances de l’échantillon telles que la stabilité ou la disponibilité. La quantité de protéines requise par injection varie inversement avec le poids moléculaire – deux fois plus de masse protéique est nécessaire si le poids moléculaire est de 33 kDa, soit la moitié de celle de BSA. 4. Préparation du logiciel MALS Ouvrir nouveau Expérimentez à partir de la méthode dans le menu logiciel MALS et sélectionnez la méthode en ligne à partir du dossier des méthodes du système de diffusion de lumière. Si un détecteur DLS est présent, sélectionnez la méthode en ligne à partir de la diffusion de la lumière Avec dossier QELS. Dans la section Configuration, définiz les paramètres de l’échantillon et de la phase mobile. Dans la vue Pompe générique, définir le débit de celui utilisé dans le FPLC. Dans la vue Pompe générique, Branche solvant, Champ nom, sélectionnez PBS. Dans la vue Injecteur, branche d’échantillon, entrez le nom sous le nom de BSA, et fixez dn/dc 0,185 (valeur standard pour les protéines non modifiées), A2 et 0, et coefficient d’extinction UV 0,667 ml/mg-cm).REMARQUE : Pour d’autres protéines, le coefficient d’extinction UV280 nm peut être trouvé dans la littérature ou calculé à partir de sa séquence à l’aide de divers outils logiciels du domaine public. Dans la section Procédures, vue Collection de base, sélectionnez la case à cocher Trigger sur Autoinject et fixez la durée de l’exécution à 70 min afin que les données soient collectées pour l’ensemble de l’élution jusqu’à ce que le volume total de perméation de la SEC colonne est atteint.REMARQUE : Le temps nécessaire peut varier en fonction du débit de la colonne et du débit – 35 min de collecte sont nécessaires pour une colonne HPLC-SEC standard de 7,8 mm x 300 mm à 0,5 ml/min. Démarrez l’expérience dans le logiciel MALS en cliquant sur le bouton Run. Il commencera à lire les données après avoir reçu le signal d’impulsion de l’instrument FPLC via le détecteur MALS. Zéro le signal dRI en cliquant sur le bouton Autozero sur le panneau avant de l’instrument. 5. Préparation du logiciel FPLC Insérer le nom de la protéine et la course dans le logiciel FPLC, dans Manuel Exécuter les instructions manuelles Définir la marque. Passer la soupape d’injection de la charge manuelle à l’injection sous la trajectoire de flux . Valve d’injection. Inclure un signal d’impulsion en insérant une impulsion de 0,5 sous la boîte I/O. Pulse numérique . Cela déclenchera la collecte de données dans le logiciel MALS. 6. Injecter l’échantillon dans la boucle. Cliquez sur Exécuter dans le logiciel FPLC pour démarrer l’exécution de l’expérience. 7.Analyse des données SEC-MALS BSA Effectuez l’analyse, étape par étape, sous la section Procédures du logiciel MALS. Vérifier que les pics apparaissent, à peu près le même volume d’élution dans UV, MALS et RI, en vérifiant la vue de la collection de base. Dans la vue Baseline, définissez la ligne de base pour tous les signaux (tous les détecteurs LS, UV et dRI). Les lignes de base doivent être définies pour indiquer le niveau de solvant pur, s’étendant d’un côté des pics d’échantillon à l’autre. Dans la vue Peaks, définissez les pics à analyser en cliquant et en faisant glisser la souris. Sélectionnez les 50 % centraux de chaque pic. Sélectionnez d’abord le pic monomère (‘Peak 1’) puis le pic dimère (‘Peak 2’). Vérifier les valeurs correctes de dn/dc 0,185 et UV 280 nm coefficient d’extinction – 0,667 pour BSA sous chaque pic. Effectuer des procédures d’alignement de pointe, d’élargissement de la bande et de normalisation.REMARQUE : Normalement, la méthode SEC-MALS est périodiquement calibrée pour l’alignement de pointe, l’élargissement de la bande et la normalisation des détecteurs angulaires au détecteur de 90 degrés à l’aide d’une protéine monodispersée avec un rayon de giration Rg ‘lt; 10 nm tels que BSA tels que BSA Monomère. Dans cet exemple, BSA sert à la fois de molécule d’étalonnage et fait lui-même l’objet d’une analyse MW. Dans les procédures Vue d’alignement, sélectionnez la région centrale des pics en cliquant et en faisant glisser la souris, cliquez sur Signaux align et puis OK. Dans les procédures Vue d’élargissement de bande, choisissez le centre 50% du pic monomère. Assurez-vous que le détecteur RI est spécifié comme l’instrument de référence, puis cliquez sur Perform Fit et Apply pour correspondre aux signaux UV et LS au signal RI. Zoom sur les pics pour vérifier qu’ils se chevauchent très étroitement dans le centre 50-70%, puis cliquez sur OK. Si le chevauchement n’est pas parfait, (il peut être nécessaire de) effectuer l’ajustement et “Appliquer” une ou deux fois de plus jusqu’à ce que le chevauchement est excellent. Dans les procédures Vue de normalisation, sélectionnez Peak 1, entrez 3,0 nm comme valeur Rg, cliquez sur Normaliser puis OK. Dans les procédures Molar Mass et Rg de la vue MALS, examinent les données pour déterminer quels angles de détection, le cas échéant, doivent être retirés de l’analyse en raison d’un bruit excessif. Typiquement, ce sont les angles inférieurs dans lesquels les particules de poussière dispersent une intensité relativement élevée. Sélectionnez des tranches individuelles dans les pics à partir du graphique à droite et affichez la dépendance angulaire du rapport Rayleigh réduit inverse dans le graphique à gauche. Si les angles les plus bas (et parfois les plus élevés) s’écartent systématiquement considérablement de l’ajustement, puis les désélectionnez de la liste au bas de la vue. Afficher le graphique des résultats dans la vue EASI Graph. Sélectionnez Molar Mass à partir de l’affichage déroulant en haut de la fenêtre. Utilisez Ctrl et faites glisser pour zoomer sur la région de pointe. Afficher les résultats définitifs de masse molaire tabulé e en poids moyen pour les pics monomères et dimères dans les résultats. Afficher le rapport (résumé) sous Résultats de pointe Moments de masse molaire (g/mol) Mw. La pureté est signalée sous les résultats de pointe (fr) Fraction de masse(%).REMARQUE : D’autres moments de masse molaire sont également montrés ; ceux-ci sont habituellement pertinents pour les polymères hétérogènes, mais pas pour les protéines de tailles discrètes. Beaucoup d’autres résultats produits par le logiciel peuvent être inclus dans le rapport tels que la récupération de masse en pourcentage (la fraction de protéine qui a éludé par l’intermédiaire du détecteur de concentration par rapport à la quantité injectée), les statistiques de pointe, la polydispersity, Rg et Rh moments, etc. Lorsqu’elles sont fournies, les mesures de l’incertitude reflètent la précision de la valeur citée en fonction du bruit dans la série de mesures et ne doivent pas être considérées comme représentant l’exactitude. La véritable exactitude des valeurs déclarées dépend de divers facteurs tels que l’exactitude des valeurs fournies dn/dc et les coefficients d’extinction, l’étalonnage des instruments, etc. Dans le menu Fichier, sélectionnez Enregistrer comme Méthode et enregistrer les données BSA analysées comme méthode standard pour les mesures futures de tous les types de protéines. Les paramètres de normalisation et d’élargissement des bandes déterminés pour la BSA seront reportés dans l’analyse.

Representative Results

Figure 1a,b montrent que trois formes oligomériques de BSA : monomère, dimère et trimère, étaient bien séparées sur la colonne de 200 pore avec une résolution de base de monomère et de dimère, tandis que la figure 2a montre que la séparation sur une colonne de 75 porence n’a pas obtenir une bonne résolution monomère-dimère. Ce dernier exemple a été inclus pour illustrer un résultat “pauvre”; ces différences de séparation pour les deux colonnes peuvent, en fait, être attendues selon les plages de séparation déclarées du fabricant. Le trimère n’est pas complètement séparé du dimère et les oligomères supérieurs ne sont pas bien séparés du trimère et de l’autre. La figure 2b est un exemple de signal de diffusion de lumière bruyante avec des particules présentes dans tout le chromatogramme, ce qui empêche une détermination précise du MW. Dorénavant, nous nous concentrons sur la figure 1b. Le monomère, qui a elué à 13,8 ml, présente une masse molaire moyenne de poids Mw de 64,1 à 0,4 kDa déterminée par LE MALS et le rayon hydrodynamique Rh de 3,54 à 0,01 nm. Ces résultats sont en accord avec la masse de séquence et le rayon hydrodynamique connu de BSA, 66,4 kDa et 3,5 nm respectivement68, à l’exactitude habituelle de SEC-MALS, 5%3,69. Le dimère, qui a elué à 12 ml, a exhibé une valeur de Mw de 127 – 1 kDa déterminée par MALS-comme prévu, deux fois celle du monomère à l’intérieur de la précision expérimentale -et Rh de 5,68 à 0,06 nm. Le pic trimère a également été observé à 11 ml avec Mw de 194 à 9 kDa déterminé par MALS, trois fois plus que le monomère dans une précision expérimentale, comme prévu. R (en) h du trimère n’a pas pu être déterminée en raison de la faible intensité du signal DLS. Les points de masse molaires calculés à travers le pic monomère sont uniformes à moins de 2-5%, ce qui indique l’homogénéité. Il n’est pas rare de trouver une épaule de fuite avec la masse molaire dans la gamme de 38-50 kDa, correspondant aux fragments de BSA70. Les points de masse molaire à travers les pics dimériques et trimeric ne sont pas uniformes, ce qui indique l’hétérogénéité. Le pic dimère est quelque peu hétérogène en raison de traces de trimer qui saignent dans le pic dimer, et le pic trimer est hétérogène en raison de la co-élution d’oligomères plus élevés mal résolus. Le niveau de signal-bruit du pic monomère est tout à fait acceptable dans les trois signaux, au-dessus de 100:1, tout comme le pic dimère avec signal-au-bruit de 40:1. Les régions de chromatogramme au-delà des pics protéiques sont plates, à l’exception d’un pic dû à des particules proches du volume d’exclusion totale (vide) dans la trace de LS et d’un pic de sel (positif) et d’un pic d’air (négatif) dissous dans la trace d’IRD, près de la perméation totale volume. Ceux-ci sont indiqués dans la figure 1a. Le niveau de pureté peut également être calculé dans une expérience SEC-MALS : la fraction de masse du pic monomeric dans le rapport représente le pourcentage de pureté de la forme monomeric. Pour le monomère BSA, la pureté calculée est de 88%. Figure 1 : Analyse SEC-MALS de l’albumine de sérum bovin (BSA) à l’aide d’une colonne d’exclusion de taille de 200 pore. Les traces de chromatogramme sont normalisées au sommet du monomère et décalées pour plus de clarté. (A) Les artefacts communs qui peuvent être ignorés sont signalés, y compris un pic de particules près du début du signal de diffusion de la lumière ainsi que des pics de sel et d’air dissous près du volume total de perméation dans le signal d’indice de réfraction. (B) Le chromatogramme présente une excellente séparation monomère-dimer-trimère et le signal de diffusion de la lumière montre un signal-au-bruit élevé. Les valeurs monomères et dimères MW présentent une forte homogénéité. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 2 : Exemples d’analyses SEC-MALS de mauvaise qualité. Les traces de chromatogramme sont normalisées au sommet du monomère et décalées pour plus de clarté. (A) Séparation inadéquate sur une colonne d’exclusion de taille de 75 pore; un pic de particules entre 8 et 9 min n’est pas bien séparé des protéines. (B) Un rapport signal-bruit inadéquat et des particules étendues adjacentes aux protéines sont apparentes dans le signal de diffusion de la lumière (LS). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

L’expérience SEC-MALS a fourni une bonne séparation du monomère, du dimère et du trimère, ainsi que des résultats quantitatifs pour les masses molaires et les tailles hydrodynamiques de chaque pic. Cela identifie et caractérise clairement chaque espèce présente, ainsi que la quantification de la pureté. Habituellement, les résultats obtenus sont précis à moins de 5%, et précis et répétable à moins de 1-2%³^,⁶⁹. Ce niveau de précision et de répétabilité permet de distinguer en toute confiance les espèces qui peuvent être proches en MW, tant qu’elles sont séparées par la SEC (peut se chevaucher partiellement dans le même pic). Les avantages pour le contrôle de la qualité des protéines et la caractérisation biophysique fondamentale sont évidents.

La vérification de l’absence de particules est très importante pour les mesures sensibles et répétables SEC-MALS. Les pics de particules apparaissent généralement sous forme de signaux MALS importants non accompagnés de signaux UV ou RI comparables. La phase mobile et l’échantillon doivent être préparés avec soin pour éliminer ces particules. Utilisation de réactifs de qualité HPLC ou mieux, filtration de la phase mobile et tampon de dilution à 0,1 – 0,2 m (pré-lavage du filtre pour éliminer les particules qui sont toujours présents sur les membranes sèches), maintien de bouteilles de phase mobile extra-propre et autres verreries pour SEC-MALS et l’équilibrage prolongé de colonne sous courant (pour enlever les particules et les agrégats qui peuvent s’être accumulés lorsque le débit a été arrêté ou une colonne non utilisée) sont tous recommandés. L’échantillon doit être filtré à la plus petite taille de pores qui n’enlève pas le matériau d’intérêt, généralement pas plus grand que 0,1 m et, si possible, 0,02 m. Si le filtre obstrue rapidement, l’échantillon peut être centrifugé, filtré à des stades de taille descendante des pores et/ou repurifié. Lorsque les systèmes sont constamment maintenus avec une phase mobile de haute qualité, fraîche et filtrée, que les chocs de colonne sont évités, que les échantillons sont propres et qu’ils n’adhèrent pas à la colonne, les mesures n’exhiberont pas le bruit de particules susmentionné et fourniront données de haute qualité.

MALS est agnostique aux tampons typiques de SEC pour des protéines ; beaucoup d’autres systèmes tampons en plus de PBS peuvent être utilisés pour optimiser la séparation et la stabilité, y compris une variété d’excipients⁷¹. MALS est également agnostique à la colonne spécifique, qui doit être sélectionnée pour une séparation et une récupération optimales. Les principales préoccupations des excipients en ce qui concerne l’analyse sont des changements significatifs dans l’indice de réfraction, conduisant à la modification de l’indice réfractif spécifique dn/dc, et les excipients qui absorbent 280 nm lorsque l’analyse UV est nécessaire. Par exemple, l’arginine est une excipiente commune de réduction de l’agrégation qui peut affecter considérablement le dn/dc d’une protéine typique, même en l’amenant dans le régime négatif (une protéine avec dn/dc négatif peut encore être analysée par SEC-MALS si dn/ dc est déterminé empiriquement, mais si dn/dc 0 l’intensité de la lumière dispersée par la protéine sera nulle et l’analyse DE MW sera impossible). Le sujet des valeurs dn/dc pour les protéines est longuement discuté par Zhao et al.³⁵ où il est démontré que pour les tampons aqueux standard, la grande majorité des protéines non modifiées se situent dans 2-3% de la valeur standard (0,185 ou 0,186 mL/g à 660 nm) , bien que les protéines inférieures à 10 kDa soient plus variables, et il y a quelques espèces qui peuvent aller jusqu’à 0,21 ml/g.

Les profils MW à travers les pics de monomère et de dimère de BSA dans les données présentées étaient tous deux assez homogènes à moins de 2% ou moins, indiquant des espèces monodispersées. Les valeurs MW non uniformes d’un sommet peuvent résulter d’une hétérogénéité ou d’une analyse incorrecte. En particulier, un profil BSA MW qui est concave («sourire») ou convexe («grimace») pourrait résulter de ne pas appliquer correctement la correction de bande-élargissement. Pour d’autres protéines, un profil convexe pourrait également résulter de l’équilibre dynamique entre les monomères et les oligomères, où le rapport de monomère à oligomère – et donc la valeur apparente de MW – dépend de la concentration maximale (BSA ne présente pas ce comportement et est souvent utilisé comme échantillon témoin pour vérifier les paramètres d’élargissement corrects de la bande). Un profil MW qui varie de la tête au bord de fuite et qui ne change pas avec la concentration de l’échantillon est typique d’une répartition des espèces de poids moléculaire qui sont partiellement résolues par la SEC. L’équilibre dynamique se distingue facilement de l’autre les sources de distributions apparemment inhomogènes en injectant différentes quantités totales de protéines -la distribution variera avec l’équilibre dynamique, mais pas avec une distribution fixe ou une correction incorrecte de l’élargissement de la bande.

Compte tenu des contraintes décrites ci-dessus, SEC-MALS n’est pas adapté à diverses tâches. Il ne convient pas à l’analyse d’échantillons bruts; les échantillons doivent être bien purifiés par des méthodes standard d’affinité et de polissage. Il n’a pas suffisamment de précision ou de puissance de résolution pour identifier les mutants et les variantes d’une protéine ou d’un mAb avec la même masse ou très proche, et ne peut pas être utilisé avec des analytes qui ne s’échappent pas ou ne se séparent pas sur une colonne SEC, bien que récemment il a été démontré que ion-exchang e ou la chromatographie en phase inverse peut être combinée avec MALS pour séparer et caractériser les espèces qui ne sont pas résolues par SEC⁷²^,⁷³^,⁷⁴. Lorsque les quantités de protéines sont sévèrement limitées, SEC-MALS peut ne pas être faisable car il nécessite généralement 10 – 200 g³ et même plus peut être nécessaire par un système FPLC avec un diamètre intérieur de tuyauterie supérieur à 0,25 mm; cependant, de plus petites quantités peuvent être analysées par UHPLC-SEC-MALS. Les protéines très instables qui s’agrégent lors de l’introduction à la phase mobile ne conviennent pas à l’analyse SEC-MALS, bien que l’optimisation tampon utilisant la diffusion de lumière dynamique hors ligne puisse surmonter ce problème⁷⁵.

Malgré les efforts supplémentaires que la SEC-MALS implique, il est inestimable pour la recherche sur les protéines et est largement utilisé par les communautés universitaires et biopharmaceutiques. En plus de la caractérisation des monomères, des oligomères et des agrégats tel que décrit dans le protocole ci-dessus, SEC-MALS peut caractériser des protéines modifiées telles que les glycoprotéines (déterminer le MW des composants protéiques et glycanes individuellement), les surfactants ou protéines membranaires sorubilisées (déterminant le MW des composants des protéines et des composants de solubiliseur individuellement), assemblages de protéines tels que particules virales, protéines-protéines et complexes d’acide nucléique protéique, polysaccharides, conjuguées de protéines-polysaccharide, peptides et bien d’autres biomacromolécules.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions le Dr Tsafi Danieli (Wolfson Centre for Applied Structural Biology, Hebrew University) pour ses conseils et ses collaborations. Nous remercions également Daniel Biotech Ltd. (Rehovot, Israel) pour l’aide et la mise en place du système analytique FPLC-MALS utilisé dans cette étude.

Materials

AKTA pure	GE Healthcare	29-0182-26	fast protein liquid chromatograph (FPLC)
AKTA UNICORN	GE Healthcare		FPLC control software
ASTRA	Wyatt Technology		MALS data acquisition and analysis software
Bovine serum albumine (purity >97%)	Sigma	A1900	analyte
DAWN or miniDAWN	Wyatt Technology	WH2 or WTREOS	multi-angle light scattering (MALS) detector
Increase 200 10/300	GE Healthcare		size exclusion column, 200 Å pores, 10 mm i.d., 300 mm length
Optilab	Wyatt Technology	WTREX	differential refractive index (RI) detector
Sodium chloride NaCl	Sigma	71382	HPLC grade NaCl
Stericup bottle top filter polyether sulfone 0.1 µm 1000 mL	Millipore	SCVPU11RE	mobile phase filter
Whatman Anotop 10 syringe filter 0.02 µm	GE Healthcare	6809-1002	sample filter
Whatman Anotop 10 syringe-tip filter, 0.1 µm pore, 10 mm diameter	GE Healthcare	6809-1012	sample filter
Whatman Anotop 25 syringe filter 0.1 µm	GE Healthcare	6809-2012	mobile phase filter
WyattQELS	Wyatt Technology	WIQ	dynamic light scattering detector

References

Acton, T. B., et al. Robotic cloning and Protein Production Platform of the Northeast Structural Genomics Consortium. Methods in Enzymology. 394, 210-243 (2005).
Acton, T. B., et al. Preparation of protein samples for NMR structure, function, and small-molecule screening studies. Methods in Enzymology. 493, 21-60 (2011).
Folta-Stogniew, E., Williams, K. R. Determination of molecular masses of proteins in solution: Implementation of an HPLC size exclusion chromatography and laser light scattering service in a core laboratory. Journal of Biomolecular Technology. 10 (2), 51-63 (1999).
Kendrick, B. S., Kerwin, B. A., Chang, B. S., Philo, J. S. Online size-exclusion high-performance liquid chromatography light scattering and differential refractometry methods to determine degree of polymer conjugation to proteins and protein-protein or protein-ligand association states. Analytical Biochemistry. 299 (2), 136-146 (2001).
Hughes, C. S., Longo, E., Phillips-Jones, M. K., Hussain, R. Quality control and biophysical characterisation data of. Data Brief. 14, 41-47 (2017).
Muthurajan, U., et al. In Vitro Chromatin Assembly: Strategies and Quality Control. Methods in Enzymology. 573, 3-41 (2016).
P4EU. . Protein Quality Standard PQS. , (2019).
Arbre Mobieu. . Guidelines on Protein Quality Control. , (2019).
Bowman, A., et al. The histone chaperones Vps75 and Nap1 form ring-like, tetrameric structures in solution. Nucleic Acids Research. 42 (9), 6038-6051 (2014).
Bowman, G. R., et al. Oligomerization and higher-order assembly contribute to sub-cellular localization of a bacterial scaffold. Molecular Microbiology. 90 (4), 776-795 (2013).
Folta-Stogniew, E. Oligomeric states of proteins determined by size-exclusion chromatography coupled with light scattering, absorbance, and refractive index detectors. Methods in Molecular Biology. 328, 97-112 (2006).
Vieux, E. F., Wohlever, M. L., Chen, J. Z., Sauer, R. T., Baker, T. A. Distinct quaternary structures of the AAA+ Lon protease control substrate degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), E2002-E2008 (2013).
Group, N.S.. . use of SEC-MALS in crystallization QC. , (2018).
Ahrer, K., Buchacher, A., Iberer, G., Josic, D., Jungbauer, A. Analysis of aggregates of human immunoglobulin G using size-exclusion chromatography, static and dynamic light scattering. Journal of Chromatography A. 1009 (1-2), 89-96 (2003).
Narhi, L. O., Schmit, J., Bechtold-Peters, K., Sharma, D. Classification of protein aggregates. Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (2), 493-498 (2012).
Spiess, C., et al. Bispecific antibodies with natural architecture produced by co-culture of bacteria expressing two distinct half-antibodies. Nature Biotechnology. 31 (8), 753-758 (2013).
Philo, J. S. A critical review of methods for size characterization of non-particulate protein aggregates. Current Pharmaceutical Biotechnology. 10 (4), 359-372 (2009).
Stellwagen, E. Gel filtration. Methods in Enzymology. 463, 373-385 (2009).
Burgess, R. R. A brief practical review of size exclusion chromatography: Rules of thumb, limitations, and troubleshooting. Protein Expression and Purification. 150, 81-85 (2018).
Striegel, A. M., Yau, W. W., Kirkland, J. J., Bly, D. D. . Modern Size-Exclusion Liquid Chromatography. , (2009).
GE Healthcare. . Size Exclusion Chromatography: Principles and Methods. , (2014).
Uliyanchenko, E. Size-exclusion chromatography-from high-performance to ultra-performance. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (25), 6087-6094 (2014).
Dunker, A. K., Silman, I., Uversky, V. N., Sussman, J. L. Function and structure of inherently disordered proteins. Current Opinion in Structural Biology. 18 (6), 756-764 (2008).
Hsiao, H. H., Nath, A., Lin, C. Y., Folta-Stogniew, E. J., Rhoades, E., Braddock, D. T. Quantitative characterization of the interactions among c-myc transcriptional regulators FUSE, FBP, and FIR. Biochemistry. 49 (22), 4620-4634 (2010).
Hayashi, Y., Takagi, T., Maezawa, S., Matsui, H. Molecular weights of alpha beta-protomeric and oligomeric units of soluble (Na+, K+)-ATPase determined by low-angle laser light scattering after high-performance gel chromatography. Biochimica et Biophysica Acta. 748 (2), 153-167 (1983).
Folta-Stogniew, E. J. Macromolecular Interactions: Light Scattering. Encyclopedia of Life Sciences. , (2009).
Hong, P., Koza, S., Bouvier, E. S. P. Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein Biotherapeutics and their Aggregates. Journal of Liquid Chromatography and Related Technology. 35 (20), 2923-2950 (2012).
Chakrabarti, A. Separation of Monoclonal Antibodies by Analytical Size Exclusion Chromatography. Antibody Engineering. , (2018).
Wyatt, P. J. Light scattering and the absolute characterization of macromolecules. Analytica Chimica Acta. 272, (1993).
Takagi, T. Application of low-angle laser light scattering detection in the field of biochemistry: review of recent progress. Journal of Chromatography A. 506, 51-63 (1990).
Wen, J., Arakawa, T., Philo, J. S. Size-exclusion chromatography with on-line light-scattering, absorbance, and refractive index detectors for studying proteins and their interactions. Analytical Biochemistry. 240 (2), 155-166 (1996).
Mogridge, J. Using light scattering to determine the stoichiometry of protein complexes. Methods in Molecular Biology. 1278, 233-238 (2015).
Larkin, M., Wyatt, P. J. Light-Scattering Techniques and their Application to Formulation and Aggregation Concerns. Formulation and Process Development Strategies for Manufacturing Biopharmaceuticals. , (2010).
Wolfender, J. L. HPLC in Natural Product Analysis: The Detection Issue. Planta Medica. 75 (07), 719-734 (2009).
Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. On the distribution of protein refractive index increments. Biophysical Journal. 100, (2011).
Serebryany, E., Folta-Stogniew, E., Liu, J., Yan, E. C. Homodimerization enhances both sensitivity and dynamic range of the ligand-binding domain of type 1 metabotropic glutamate receptor. FEBS Letters. 590 (23), 4308-4317 (2016).
Arakawa, T., Wen, J. Size-exclusion chromatography with on-line light scattering. Current Protocols in Protein Science. Chapter 20, Unit 20.6 (2001).
Müller, R., et al. High-resolution structures of the IgM Fc domains reveal principles of its hexamer formation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (25), 10183-10188 (2013).
Slotboom, D. J., Duurkens, R. H., Olieman, K., Erkens, G. B. Static light scattering to characterize membrane proteins in detergent solution. Methods. 46 (2), 73-82 (2008).
Miercke, L. J., Robbins, R. A., Stroud, R. M. Tetra detector analysis of membrane proteins. Current Protocols in Protein Science. 77, 1-30 (2014).
Gimpl, K., Klement, J., Keller, S. Characterising protein/detergent complexes by triple-detection size-exclusion chromatography. Biological Procedures Online. 18 (1), 4 (2016).
Korepanova, A., Matayoshi, E. D. HPLC-SEC characterization of membrane protein-detergent complexes. Current Protocols in Protein Science. Chapter 29, 1-12 (2012).
Roy, A., Breyton, C., Ebel, C. Analytical Ultracentrifugation and Size-Exclusion Chromatography Coupled with Light Scattering for Characterization of Membrane Proteins in Solution. Membrane Proteins Production for Structural Analysis. , (2014).
Hastie, K. M., et al. Crystal structure of the prefusion surface glycoprotein of the prototypic arenavirus LCMV. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (6), 513-521 (2016).
Pallesen, J., et al. Structures of Ebola virus GP and sGP in complex with therapeutic antibodies. Nature Microbiology. 1 (9), 16128 (2016).
Micoli, F., Adamo, R., Costantino, P. Protein Carriers for Glycoconjugate Vaccines: History, Selection Criteria, Characterization and New Trends. Molecules. 23 (6), (2018).
Li, J., et al. Characterizing the Size and Composition of Saposin A Lipoprotein Picodiscs. Analytical Chemistry. 88 (19), 9524-9531 (2016).
Crichlow, G. V., et al. Dimerization of FIR upon FUSE DNA binding suggests a mechanism of c-myc inhibition. EMBO Journal. 27 (1), 277-289 (2008).
Kapoor, N., Gupta, R., Menon, S. T., Folta-Stogniew, E., Raleigh, D. P., Sakmar, T. P. Nucleobindin 1 is a calcium-regulated guanine nucleotide dissociation inhibitor of G{alpha}i1. Journal of Biological Chemistry. 285 (41), 31647-31660 (2010).
Pirruccello, M., Swan, L. E., Folta-Stogniew, E., De Camilli, P. Recognition of the F&H motif by the Lowe syndrome protein OCRL. Nature Structural & Molecular Biology. 18 (7), 789-795 (2011).
Lockyer, K., Gao, F., Derrick, J. P., Bolgiano, B. Structural correlates of carrier protein recognition in tetanus toxoid-conjugated bacterial polysaccharide vaccines. Vaccine. 33 (11), 1345-1352 (2015).
Steinbach, T., Wurm, F. R. Degradable Polyphosphoester-Protein Conjugates: "PPEylation" of Proteins. Biomacromolecules. 17 (10), 3338-3346 (2016).
Das, S., Stivison, E., Folta-Stogniew, E., Oliver, D. Reexamination of the role of the amino terminus of SecA in promoting its dimerization and functional state. Journal of Bacteriology. 190 (21), 7302-7307 (2008).
Reshetnyak, A. V., et al. The strength and cooperativity of KIT ectodomain contacts determine normal ligand-dependent stimulation or oncogenic activation in cancer. Molecular Cell. 57 (1), 191-201 (2015).
Zambelli, B., et al. a Chaperone in the Urease Assembly Process, Is an Intrinsically Unstructured GTPase That Specifically Binds Zn2+. Journal of Biological Chemistry. 280 (6), 4684-4695 (2005).
Ren, X., et al. Hybrid Structural Model of the Complete Human ESCRT-0 Complex. Structure. 17 (3), 406-416 (2009).
Moriarty, D. F., Fiorillo, C., Miller, C., Colón, W. A truncated peptide model of the mutant P61A FIS forms a stable dimer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics. 1774 (1), 78-85 (2007).
la Garza, C. E., Miranda-Hernández, M. P., Acosta-Flores, L., Pérez, N. O., Flores-Ortiz, L. F., Medina-Rivero, E. Analysis of therapeutic proteins and peptides using multiangle light scattering coupled to ultra high performance liquid chromatography. Journal of Separation Science. 38 (9), 1537-1543 (2015).
Beirne, J., Truchan, H., Rao, L. Development and qualification of a size exclusion chromatography coupled with multiangle light scattering method for molecular weight determination of unfractionated heparin. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (2), 717-725 (2011).
Wang, W., et al. A new green technology for direct production of low molecular weight chitosan. Carbohydrate Polymers. 74 (1), 127-132 (2018).
Kaderli, S., et al. A novel biocompatible hyaluronic acid-chitosan hybrid hydrogel for osteoarthrosis therapy. International Journal of Pharmaceutics. 483 (1-2), 158-168 (2015).
Porterfield, J. Z., Zlotnick, A. A Simple and General Method for Determining the Protein and Nucleic Acid Content of Viruses by UV Absorbance. Virology. 407 (2), 281-288 (2010).
Podzimek, S. The use of GPC coupled with a multiangle laser light scattering photometer for the characterization of polymers. On the determination of molecular weight, size and branching. Journal of Applied Polymer Science. 54 (1), 91-103 (1994).
Podzimek, S., Vlcek, T., Johann, C. Characterization of branched polymers by size exclusion chromatography coupled with multiangle light scattering detector. I. Size exclusion chromatography elution behavior of branched polymers. Journal of Applied Polymer Science. 81 (7), 1588-1594 (2001).
Podzimek, S. Importance of Multi-Angle Light Scattering in Polyolefin Characterization. Macromolecular Symposia. 330 (1), 81-91 (2013).
Tarazona, M. P., Saiz, E. Combination of SEC/MALS experimental procedures and theoretical analysis for studying the solution properties of macromolecules. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 56 (1), 95-116 (2003).
Minton, A. P. Recent applications of light scattering measurement in the biological and biopharmaceutical sciences. Analytical Biochemistry. 501, 4-22 (2016).
Hirayama, K., Akashi, S., Furuya, M., Fukuhara, K. Rapid confirmation and revision of the primary structure of bovine serum albumin by ESIMS and frit-FAB LC/MS. Biochemical and Biophysical Research Communications. 173 (2), 639-646 (1990).
Zhu, H., Ownby, D. W., Riggs, C. K., Nolasco, N. J., Stoops, J. K., Riggs, A. F. Assembly of the gigantic hemoglobin of the earthworm Lumbricus terrestris. Roles of subunit equilibria, non-globin linker chains, and valence of the heme iron. The Journal of biological chemistry. 271 (47), 30007-30021 (1996).
Peters, T., Feldhoff, R. C. Fragments of bovine serum albumin produced by limited proteolysis. Isolation and characterization of tryptic fragments. Biochemistry. 14 (15), 3384-3391 (1975).
Lebendiker, M., Danieli, T. Production of prone-to-aggregate proteins. FEBS Letters. 588 (2), 236-246 (2014).
Amartely, H., Avraham, O., Friedler, A., Livnah, O., Lebendiker, M. Coupling Multi Angle Light Scattering to Ion Exchange chromatography (IEX-MALS) for protein characterization. Scientific Reports. 8 (1), 6907 (2018).
Astafieva, I. V., Eberlein, G. A., John Wang, Y. Absolute on-line molecular mass analysis of basic fibroblast growth factor and its multimers by reversed-phase liquid chromatography with multi-angle laser light scattering detection. Journal of Chromatography A. 740 (2), 215-229 (1996).
Onsberg, M., Øgendal, L. H., Jensen, M. L., Howells, L. B., Andersen, B., Bjerrum, M. J. Light scattering coupled with reversed phase chromatography to study protein self-association under separating conditions. Journal of Chromatography B. 938, 60-64 (2013).
Kim, Y., et al. High-throughput protein purification and quality assessment for crystallization. Methods. 55 (1), 12-28 (2011).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Some, D., Amartely, H., Tsadok, A., Lebendiker, M. Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS). J. Vis. Exp. (148), e59615, doi:10.3791/59615 (2019).

Automatically Generated