Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Daniel Some; Hadar Amartely; Ayala Tsadok; Mario Lebendiker

doi:10.3791/59615

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Biochemistry

Caracterização de proteínas por cromatografia de exclusão de tamanho acoplada ao espalhamento de luz Multiangulares (SEC-MALS)

Published: June 20, 2019

doi:

10.3791/59615

Daniel Some¹, Hadar Amartely², Ayala Tsadok³, Mario Lebendiker²

¹Wyatt Technology Corporation, ²Wolfson Centre for Applied Structural Biology, The Alexander Silberman Institute of Life Science,The Hebrew University of Jerusalem, ³Danyel Biotech Ltd.

Summary

Este protocolo descreve a combinação de cromatografia de exclusão de tamanho com espalhamento de luz multiangulares (SEC-MALS) para caracterização absoluta de proteínas e complexos em solução. SEC-MALS determina o peso molecular e o tamanho de proteínas puras, oligomers nativos, heterocomplexos e proteínas modificadas como glicoproteínas.

Abstract

A cromatografia de exclusão de tamanho analítico (SEC), comumente utilizada para a determinação do peso molecular de proteínas e complexos proteicos protéicos em solução, é uma técnica relativa que se baseia no volume de eluição do analito para estimar a Peso. Quando a proteína não é globular ou sofre interações não-ideais da coluna, a curva da calibração baseada em padrões da proteína é inválida, e o peso molecular determinado do volume da eluição é incorreto. O espalhamento de luz de vários ângulos (MALS) é uma técnica absoluta que determina o peso molecular de um analito em solução a partir de equações físicas básicas. A combinação de SEC para separação com MALS para análise constitui um meio versátil e confiável para caracterizar soluções de uma ou mais espécies de proteínas, incluindo monómeros, oligomeros nativos ou agregados, e heterocomplexos. Uma vez que a medição é realizada em cada volume de eluição, SEC-MALS pode determinar se um pico de eluição é homogêneo ou heterogêneo e distinguir entre uma distribuição de peso molecular fixo versus equilíbrio dinâmico. Também é possível a análise de proteínas modificadas, como glicoproteínas ou lipoproteínas, ou conjugados, como proteínas de membrana solubilizadas em detergente. Assim, a SEC-MALS é uma ferramenta crítica para o químico protéico que deve confirmar as propriedades biofísicas e o comportamento da solução de moléculas produzidas para pesquisa biológica ou biotecnológica. Este protocolo para SEC-MALS analisa o peso molecular e o tamanho de monômeros e agregados de proteínas puras. Os dados adquiridos servem como base para novas análises de SEC-MALS, incluindo as de complexos, glicoproteínas e proteínas de membrana acoplada a surfactante.

Introduction

A análise confiável do peso molecular (MW) das proteínas em solução é essencial para a pesquisa biomolecular¹^,²^,^3,4. A análise de MW informa o cientista se a proteína correta foi produzida e se é adequada para uso em outras experimentações^5,6. Conforme descrito nos sítios Web das redes de investigação proteica P4EU⁷ e Arbre-Mobieu⁸, o controlo da qualidade das proteínas deve caracterizar não só a pureza do produto final, mas também o seu estado oligomérico, homogeneidade, identidade, conformação, estrutura, modificações pós-tradução e outras propriedades.

A medida de MW na solução de não-desnaturação identifica a forma da proteína que está presente em um ambiente aquoso, seja monomérico ou oligomérico. Enquanto para muitas proteínas o objetivo é produzir a forma monomérica, para outros um oligomero nativo específico é a chave para a atividade biológica⁹^,¹⁰^,^11,12. Outros oligômeros e agregados não nativos são indesejáveis e levarão a falhas na determinação estrutural por cristalografia, ressonância magnética nuclear (RMN) ou espalhamento de raios-X de pequeno ângulo, bem como artefatos ou imprecisões em ensaios funcionais para quantificar a ligação por calorimetria de Titulação Isotérmica ou ressonância Plasmon superficial²^,13.

No caso de bioterapêutica, tais como anticorpos monoclonais (mAbs), a análise de MW baseada em solução serve um propósito semelhante de controle de qualidade e caracterização do produto. Agregados e fragmentos excessivos são indicativos de um produto instável que não é adequado para uso humano. As agências reguladoras necessitam de uma caracterização cuidadosa, não só da molécula terapêutica, mas também de degradantes potenciais que possam estar presentes no produto final¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷.

Alguns dos métodos mais difundidos para a análise da proteína MW são a eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecilo sulfato de sódio (SDS-PAGE), eletroforese capilar (CE), página nativa, espectrometria de massas (MS), cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) e análise (AUC). Destes, o SDS-Page, o CE e o MS não são executados no estado nativo e conduzem tipicamente à dissociação dos oligômeros e dos agregados, daqui não são apropriados para determinar os agregados Oligomer ou quantificar nativos. Embora nativo PAGE faz, teoricamente, manter o estado nativo, em nossa experiência é difícil de otimizar para muitas proteínas, e os resultados não são muito confiáveis. A AUC, seja pela velocidade de sedimentação ou pelo equilíbrio da sedimentação, é quantitativa e pode determinar a MW dos primeiros princípios, mas é bastante complicada, exigindo muito trabalho manual e experiência significativa na interpretação dos dados, tempo de experimento longo e um instrumento muito caro.

O SEC analítico é um método quantitativo e relativamente robusto e simples que separa as macromoléculas durante o fluxo através de uma coluna embalada. Os princípios e aplicações da SEC são bem apresentados em várias revisões¹⁸^,¹⁹^,²⁰ e no manual “cromatografia de exclusão de tamanho: princípios e métodos”²¹. As diferenças de retenção são devidas a diferentes quantidades de tempo gasto difundidos para dentro e para fora dos poros na fase estacionária antes de eluição a partir do final da coluna. As diferenças surgem (nominalmente) dos tamanhos relativos e dos coeficientes de difusão das moléculas²². Uma curva de calibração é construída usando uma série de moléculas de referência, relacionando o MW da molécula ao volume de eluição. Para as proteínas, as moléculas de referência são geralmente bem comportados, proteínas globulares que não interagem com a coluna através de carga ou resíduos de superfície hidrofóbica. O volume de eluição é medido com um detector de absorvância ultravioleta (UV). Se o coeficiente de extinção UV é conhecido-muitas vezes calculado a partir da seqüência-o pico de proteína massa total também pode ser quantitated.

Notavelmente, a análise de MW pela SEC baseia-se em dois pressupostos-chave sobre as proteínas a serem caracterizadas: 1) eles compartilham com os padrões de referência a mesma conformação e volume específico (em outras palavras, a mesma relação entre as propriedades de difusão e MW) e 2) como os padrões de referência, eles não interagem com a coluna, exceto por Propriedades esteric-eles não aderir à coluna de embalagem por carga ou interações hidrofóbicas. Os desvios dessas suposições invalidam a curva de calibração e levam a determinações errôneas de MW. Este é o caso para as proteínas intrinsecamente desordenadas que têm grandes raios de Stokes devido às suas extensas regiões não estruturadas²³^,²⁴ ou não-esférica/linear oligomérica conjuntos¹⁰. As proteínas glicosiladas geralmente têm um raio maior de Stokes do que a forma não glicosilada, mesmo quando a massa de carboidratos adicionada é levada em conta¹⁹. Proteínas de membrana detergente-solubilizadas eluir diferentemente das proteínas da calibração porque sua eluição da SEC depende do tamanho total do complexo polipeptídeo-detergente-lipídeos em vez do estado oligomérico e massa molar da proteína²⁵ ^,²⁶. As condições de química, pH e sal da coluna afetam os volumes de eluição de proteínas com resíduos de superfície carregados ou hidrofóbicos²⁷^,²⁸.

SEC torna-se muito mais versátil e confiável para determinação de MW quando combinado com multi-ângulo de dispersão de luz (mals) e diferencial de índice de refração (dRI) detectores³^,⁴^,¹¹^,²⁹^, ³⁰^,³¹^,³². Um detector dRI determina a concentração com base na alteração do índice de refração da solução devido à presença do analito. Um detector MALS mede a proporção de luz dispersa por um analito em múltiplos ângulos em relação ao feixe de laser incidente. Coletivamente conhecido como SEC-MALS, esta instrumentação determina MW independentemente do tempo de eluição, uma vez que o MW pode ser calculado diretamente a partir dos primeiros princípios usando a equação 1,

1

onde M é o peso molecular do analito, R (0) a proporção reduzida de Rayleigh (i.e., a quantidade de luz dispersa pelo analito em relação à intensidade do laser) determinada pelo detector mals e extrapolada para o ângulo zero, c o concentração de peso determinada pelo detector UV ou dRI, DN/DC o incremento do índice de refração do analito (essencialmente a diferença entre o índice de refração do analito e o tampão), e K uma constante óptica que depende da Propriedades do sistema tais como o comprimento de onda e o índice refração solvente²⁹.

Na SEC-MALS, a coluna SEC é usada unicamente para separar as várias espécies em solução para que elas entrem no MALS e nas células do detector de concentração individualmente. O tempo de retenção real não tem significância para a análise, exceto na medida em que ele resolve as espécies de proteínas. Os instrumentos são calibrados independentemente da coluna e não dependem de padrões de referência. Assim, o SEC-MALS é considerado um método ‘ absoluto ‘ para determinação de MW a partir de equações físicas básicas. Se a amostra for heterogênea e não completamente separada pela coluna, então o valor fornecido em cada volume de eluição será uma média de peso das moléculas em cada volume de eluição que flui através da célula de fluxo por fatia de tempo, aproximadamente 75 μL.

Por análise da variação angular da intensidade de espalhamento, o MALS também pode determinar o tamanho (raio raiz-médio-quadrado, R_g) de macromoléculas e nanopartículas com raio geométrico maior do que cerca de 12,5 Nm²⁹. Para espécies menores, como proteínas monoméricas e oligomers, um módulo dinâmico de espalhamento de luz (DLS) pode ser adicionado ao instrumento MALS, a fim de medir raios hidrodinâmicos de 0,5 nm e até³³.

Enquanto a análise de concentração UV ou dRI pode fornecer o valor de c em EQ. 1, o uso de Dri é preferível por duas razões: 1) Dri é um detector de concentração universal, adequado para analisar moléculas como açúcares ou polissacarídeos que não contêm um UV cromophore³⁴; e 2) a resposta de concentração DN/DC de quase todas as proteínas puras em tampão aquoso é a mesma para dentro de um ou dois por cento (0,185 ml/g)³⁵, então não há necessidade de saber o coeficiente de extinção UV.

O uso de SEC-MALS na pesquisa proteica é bastante extenso. De longe, as aplicações mais comuns estão estabelecendo se uma proteína purificada é monomérica ou oligomérica e o grau de oligomerização, e avaliando os agregados³^,¹⁰^,¹¹^,¹⁷^, ³¹^,³⁶^,³⁷^,³⁸. A capacidade de fazê-lo para proteínas de membrana detergente-solubilizadas que não podem ser caracterizadas por meios tradicionais é especialmente valorizada, e protocolos detalhados para isso foram publicados³¹^,³⁹^,⁴⁰ ^, ⁴¹ ^, ⁴² ^, ⁴³. outras aplicações comuns incluem o estabelecimento do grau de modificação pós-translacional e de polidispersidade de glicoproteína, lipoproteínas e conjugados similares⁴^,³¹^,⁴⁴ ^, ⁴⁵ ^, ⁴⁶ ^, ⁴⁷; a formação (ou falta dela) e a estequiometria absoluta (em oposição à relação estequiométrica) de heterocomplexos, incluindo proteína-proteína, ácido proteico-nucleico e complexos de proteína-polissacarídico²⁴^,⁴⁶^, ⁴⁸^,⁴⁹^,⁵⁰^,⁵¹^,⁵²; determinando a constante de dissociação do equilíbrio monómero-dímero⁴⁹^,⁵³^,⁵⁴; e avaliando a conformação proteica⁵⁵^,⁵⁶. Além das proteínas, os SEC-mals são inestimáveis para caracterização de peptídeos⁵⁷^,⁵⁸, polímeros naturais amplamente heterogêneos, como heparinas⁵⁹ e quitosanas⁶⁰^,⁶¹, pequenas vírus⁶² e a maioria dos tipos de polímeros sintéticos ou processados⁶³^,⁶⁴^,⁶⁵^,⁶⁶. Uma extensa bibliografia pode ser encontrada na literatura⁶⁷ e online (em http://www.Wyatt.com/Bibliography).

Aqui, apresentamos um protocolo padrão para executar e analisar um experimento SEC-MALS. A albumina sérica bovina (BSA) é apresentada como um exemplo para a separação e caracterização de monômeros proteicos e oligomeros. O protocolo BSA determina certas constantes do sistema que servem como base para análises de SEC-MALS adicionais, incluindo as de complexos, glicoproteínas e proteínas de membrana ligadas a surfactante.

Notamos que a SEC-MALS pode ser realizada usando cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) ou equipamento de cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC) de muitos fornecedores. Este protocolo descreve o uso de um sistema FPLC comumente encontrado em laboratórios que produzem proteínas para pesquisa e desenvolvimento (ver tabela de materiais). Antes de executar o protocolo, o sistema FPLC, os detectores MALS e dRI deveriam ter sido instalados, juntamente com seus respectivos pacotes de software para controle, aquisição e análise de dados por instruções dos fabricantes e quaisquer constantes de calibração necessárias ou outras configurações inseridas no software. Um filtro embutido deve ser colocado entre a bomba e o injector com uma membrana hidrófila de poros de 0,1 μm instalada.

Protocol

1. preparação do sistema Conecte os detectores MALS e dRI a jusante do detector UV do FPLC. Contorne os detectores de pH e condutividade, pois eles acrescentarão um volume significativo entre os detectores UV e MALS. Use tubos capilares de 0,25 mm de identificação da coluna para e entre os detectores, e 0,75 mm identificar tubos capilares na saída dos detectores de resíduos ou coletor de fração. Assegure-se de que as conexões de sinal necessárias entre o FPLC e os detectores tenham sido estabelecidas, incluindo a saída analógica do detector UV para a entrada analógica MALS, e a saída digital do FPLC para o MALS Autoinject, através da caixa de e/s do FPLC. Instale uma coluna analítica adequada SEC cobrindo uma gama de fraccionamento de pelo menos 20 kDa para 500 kDa. Verifique a informação do produto para determinar se a coluna é adequada para a gama de MW, pH e outras propriedades da amostra e fase móvel. 2. preparação do tampão, f levam o sistema durante a noite e verificando a limpeza Usando reagentes de HPLC-grade, prepare 1 L de soro fisiológico tampão fosfato com 50-100 mM NaCl. Filtre o tampão para 0,1 μm usando um filtro de sulfona de poliéter de garrafa superior ou similar. Filtre o primeiro 50-100 ml de tampão a um frasco waste e descarte-o, a fim eliminar partículas dos filtros secos, e filtra então o restante a um frasco limpo, estéril que seja lavado completamente com água filtrada, de-ionized e tampado para impedir poeira de entrar.Nota: outros solventes de fase móvel, como um tampão Tris, podem ser utilizados se forem analisadas proteínas adicionais que são preferencialmente dissolvidas nesses solventes. Lave durante a noite a uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min, ou conforme recomendado pelo fabricante da coluna, para equilibrar a coluna no buffer e remover as partículas. Use o modo de fluxo contínuo do FPLC e assegure-se de que o fluxo não pare até que todas as execuções de SEC-mals estejam completas. Coloque a célula de fluxo dRI no modo de purga durante o flush durante a noite. Desligue a purga antes de iniciar a amostra é executada. Ao iniciar o flush, gradualmente rampa a taxa de fluxo para evitar “coluna derramamento” efeito (ou liberação de partículas) causada por uma súbita mudança de pressão na coluna. Se o sistema é conhecido por ser bastante estável e livre de partículas, e em equilíbrio com a fase móvel desejada, substitua o flush durante a noite com um menor, 2-3 h flush. Verifique a limpeza do sistema tocando levemente a tubulação a jusante da coluna para liberar as partículas acumuladas e observando o sinal no detector 90 ° na exibição do painel frontal do instrumento MALS. Verifique se o ruído de pico a pico não é mais do que 50-100 μV. Realize uma injeção “em branco” para verificar se o injector está limpo de partículas. Um ‘ Blank ‘ é simplesmente o tampão running, preparado em um frasco fresco, estéril. Se o pico de partícula não for superior a 1 mL em volume e não mais de 5 mV acima da linha de base, o sistema está pronto para amostras. Caso contrário, realize injeções em branco adicionais até limpar ou realize a manutenção para limpar o injector. 3. preparando e carregando a amostra Prepare pelo menos 200 μL de BSA em 1-2 mg/mL no tampão SEC.Nota: a fim de evitar a precipitação, BSA nunca deve ser dissolvido em água pura. Filtre a proteína para 0, 2 μm usando um filtro de ponta de seringa. Descarte as primeiras gotas de filtrado para eliminar as partículas dos filtros secos. Alternativamente, centrifugue a amostra em 10.000 x g por 15 minutos para permitir a precipitação de agregados não-solúveis e de outras partículas grandes. Injete 100 μL da solução de BSA no circuito.Nota: esta é a quantidade recomendada de material, e mais ou menos pode ser injetado de acordo com as circunstâncias da amostra, tais como estabilidade ou disponibilidade. A quantidade de proteína exigida por injeção varia inversamente com peso molecular-duas vezes mais massa protéica é necessária se o peso molecular é 33 kDa, ou metade da BSA. 4. preparação do software MALS Abrir novo | Experimente o método no menu de software mals e selecione o método online da pasta de métodos do sistema de dispersão de luz . Se um detector DLS estiver presente, selecione o método on-line do espalhamento de luz | Com a pasta QELS . Na seção configuração , defina os parâmetros da fase de exemplo e móvel. No modo de exibição de bomba genérico , defina a taxa de fluxo para a usada no FPLC. Na vista de bomba genérica , ramo de solvente , campo nome , selecione PBS. Na vista do injector , ramo de amostra , insira o nome como BSAe defina DN/DC = 0,185 (o valor padrão para proteínas não modificadas), a2 = 0 e coeficiente de extinção UV = 0,667 ml/(mg-cm).Nota: para outras proteínas, o coeficiente de extinção UV280 nm pode ser encontrado na literatura ou calculado a partir de sua seqüência usando várias ferramentas de software de domínio público. Na seção procedimentos , exibição de coleção básica , selecione o gatilho de caixa de seleção em autoinject e defina a duração da execução para 70 min para que os dados sejam coletados para toda a eluição até que o volume total de permeação da SEC coluna é atingida.Nota: a quantidade de tempo necessária pode variar com a coluna e taxa de fluxo-35 min de coleta são necessários para um padrão 7,8 mm x 300 mm HPLC-SEC coluna em 0,5 mL/min. Inicie o experimento no software MALS clicando no botão executar . Começará a ler os dados após ter recebido o sinal do pulso do instrumento de FPLC através do detetor de MALS. Zero o sinal dRI clicando no botão autozero no painel frontal do instrumento. 5. preparação do software FPLC Insira o nome da proteína e a corrida no software FPLC, em manual | Executar instruções manuais | Definir marca. Alterne a válvula de injeção da carga manual para injetar em caminho de fluxo | Válvula de injeção. Inclua um sinal de pulso inserindo um pulso de 0,5 s a caixa de I/O | Pulso digital para fora. Isso acionará a coleta de dados no software MALS. 6. Injete a amostra no circuito. Clique em executar no software FPLC para iniciar a execução do experimento. 7. análise de SEC-MALS BSA dados Execute a análise, passo a passo, a seção de procedimentos no software mals. Verifique se os picos aparecem, em aproximadamente o mesmo volume de eluição em UV, MALS e RI, verificando a exibição de coleção básica . Na visualização de linha de base , defina a linha de base para todos os sinais (todos os detectores ls, UV e dRI). As linhas de base devem ser definidas para indicar o nível de solvente puro, o alongamento preferível de um lado dos picos de amostra para o outro. Na vista de picos , defina os picos a serem analisados clicando e arrastando o mouse. Selecione o 50% central de cada pico. Primeiro, selecione o pico do monómero (‘ Peak 1 ‘) e, em seguida, o pico de dímero (‘ Peak 2 ‘). Verifique os valores corretos de DN/DC = 0,185 e coeficiente de extinção UV 280 nm = 0,667 para BSA em cada pico. Execute o alinhamento de pico, correção de ampliação de banda e procedimentos de normalização.Nota: normalmente, o método SEC-MALS é periodicamente calibrado para o alinhamento de pico, ampliação da banda e normalização dos detectores angulares para o detector de 90 ° usando uma proteína monodispersa com raio de giro Rg < 10 nm, como BSA Monômero. Neste exemplo, BSA sere ambos como a molécula da calibração e é próprio o assunto da análise do MW. Nos procedimentos | Vista de alinhamento, selecione a região central dos picos clicando e arrastando o mouse, clique em alinhar sinais e, em seguida, OK. Nos procedimentos | Band broadening View, escolha o 50% central do pico de monómero. Certifique-se de que o detector de RI é especificado como o instrumento de referênciae clique em Executar ajuste e aplique para corresponder aos sinais UV e ls ao sinal de ri. Aumente o zoom para os picos para verificar se eles se sobrepõem muito de perto dentro do 50-70% central e, em seguida, clique em OK. Se a sobreposição não é perfeita, (pode ser necessário) executar o ajuste e “aplicar” uma ou duas vezes mais até que a sobreposição é excelente. Nos procedimentos | Exibição de normalização, selecione o pico 1, digite 3,0 nm como o valor de Rg , clique em normalizar , em seguida, OK. Nos procedimentos | Massa molar e RG da visão do MALS , revise os dados para determinar quais, se houver, os ângulos de detecção devem ser desmarcados a partir da análise devido ao ruído excessivo. Tipicamente, estes serão os ângulos inferiores em que as partículas de poeira dispersam uma intensidade relativamente elevada. Selecione fatias individuais dentro dos picos do gráfico à direita e veja a dependência angular da relação de Rayleigh reduzida inversa no gráfico à esquerda. Se os ângulos mais baixos (e às vezes os mais altos) se desviam consistentemente do ajuste, então desmarque-os na lista na parte inferior da vista. Exiba o gráfico dos resultados na visualização de gráfico EASI . Selecione massa molar no menu suspenso de exibição na parte superior da janela. Use CTRL + clique e arraste para ampliar a região de pico. Veja os resultados de massa molar de peso médio tabulado final para os picos de monómero e dímero nos resultados | Exibir relatório (resumo) em resultados de pico | Momentos de massa molar (g/mol) | O MW. A pureza é relatada resultados Peak | Fração de massa (%).Nota: outros momentos de massa molar também são mostrados; Estes são geralmente relevantes para polímeros heterogêneos, mas não para proteínas com tamanhos discretos. Muitos outros resultados produzidos pelo software podem ser incluídos no relatório, como percentual de recuperação em massa (a fração de proteína que eluída através do detector de concentração em relação à quantidade injetada), estatísticas de pico, polidispersão, Rg e Rh momentos, etc. Quando fornecidas, as medidas de incerteza refletem a precisão do valor citado com base no ruído dentro da série de medição e não devem ser considerados para representar a exatidão. A exatidão verdadeira dos valores relatados depende de vários fatores tais como a exatidão dos valores fornecidos DN/DC e do coeficiente da extinção, calibração do instrumento, etc. No menu arquivo , selecione salvar como método e salvar os dados de BSA analisados como um método padrão para medições futuras de todos os tipos de proteínas. Os parâmetros de normalização e de ampliação de banda determinados para BSA serão transportados na análise.

Representative Results

Figura 1a, b mostra que três formas OLIGOMÉRICAS de BSA: monómero, dímero e trimer, foram bem separadas na coluna de poros 200 Å com resolução basal de monômero e dímero, enquanto a Figura 2a mostra que a separação em uma coluna de poros 75 å não alcançar uma boa resolução monómero-dímero. O último exemplo foi incluído para ilustrar um resultado “pobre”; Estas diferenças de separação para as duas colunas podem, de facto, ser esperadas de acordo com os intervalos de separação declarados pelo fabricante. O trimer não é separado inteiramente do dímero e os oligômeros mais elevados não são separados bem do trimer e de se. A Figura 2b é um exemplo de sinal de espalhamento de luz barulhento com partículas presentes ao longo do cromatograma, o que impede a determinação exata de MW. Doravante nos concentramos na Figura 1b. O monômero, que eluído em 13,8 mL, apresenta massa molar média de peso Mw de 64,1 ± 0,4 kDa determinado por mals e raio hidrodinâmico Rh de 3,54 ± 0, 1 nm. Estes resultados estão de acordo com a massa sequencial e o raio hidrodinâmico conhecido de BSA, 66,4 kDa e 3,5 nm, respectivamente68, para dentro da precisão usual de SEC-mals, 5%3,69. O dímero, que eluída em 12 ml, exibiu um valor de Mw de 127 ± 1 kDa determinado por mals-como esperado, duas vezes aquele do monômero a dentro da precisão experimental-e de Rh de 5,68 ± 0, 6 nanômetro. O pico de trimer também foi observado em 11 mL com Mw de 194 ± 9 kDa determinado por mals, três vezes o do monómero para dentro da precisão experimental, como esperado. R h do trimer não pôde ser determinado devido à baixa intensidade do sinal de DLS. Os pontos de massa molar calculados em todo o pico do monómero são uniformes para dentro de 2-5%, indicando homogeneidade. Não é incomum encontrar um ombro à direita com massa molar na faixa de 38-50 kDa, correspondendo a fragmentos de BSA70. Os pontos de massa molar nos picos Dimérico e trimérica não são uniformes, indicativos de heterogeneidade. O pico de dímero é um pouco heterogêneo devido a traços de trimer que sangram no pico do dímero, e o pico do Trimer é heterogêneo devido à coeluição de oligomers mais altos mal resolvidos. O nível de sinal-ruído do pico de monómero é bastante aceitável em todos os três sinais, mais de 100:1, como é o pico de dímero com sinal-ruído de 40:1. Regiões de cromatograma além dos picos proteicos são planas, com as exceções de um pico devido a partículas próximas ao volume total de exclusão (void) no traço de LS e um pico de sal (positivo) e um pico de ar dissolvido (negativo) no traço dRI, próximo à permeação total Volume. Estes são apontados na Figura 1a. O nível de pureza também pode ser calculado em um experimento SEC-MALS: a fração de massa do pico monomérico no relatório representa a porcentagem de pureza da forma monomérica. Para o monômero de BSA, a pureza calculada é 88%. Figura 1 : Análise de SEC-MALS de albumina sérica bovina (BSA) usando uma coluna de exclusão de tamanho de poros 200 Å. Os traços do cromatograma são normalizados ao pico do monómero e ao offset para a claridade. (A) artefatos comuns que podem ser ignorados são apontados, incluindo um pico de partícula próximo ao início do sinal de espalhamento de luz, bem como os picos de sal e ar dissolvido perto do volume total de permeação no sinal do índice de refratividade. (B) o cromatograma exibe a separação excelente do monómero-dímero-trimer e o sinal de espalhamento da luz exibe o sinal-à-ruído elevado. Os valores do monômero e do dímero MW exibem alta homogeneidade. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2 : Exemplos de análises de baixa qualidade da SEC-MALS. Os traços do cromatograma são normalizados ao pico do monómero e ao offset para a claridade. A) separação inadequada numa coluna de exclusão de tamanho de poros 75 Å; um pico de partícula entre 8-9 min não está bem separado das proteínas. (B) a relação sinal-ruído inadequada e as partículas extensas adjacentes às proteínas são aparentes no sinal de espalhamento de luz (ls). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

O experimento SEC-MALS proporcionou boa separação de monómero, dímero e trimero, e resultados quantitativos para as massas molares e tamanhos hidrodinâmicos de cada pico. Isso, por sua vez, identifica e caracteriza claramente cada espécie presente, bem como a quantificação da pureza. Normalmente, os resultados obtidos são precisos para dentro de 5%, e precisa e repetível para dentro 1-2%³^,⁶⁹. Este nível de precisão e repetibilidade possibilita distinguir com confiança entre as espécies que podem estar próximas em MW, desde que sejam separadas pela SEC (podem sobrepor-se parcialmente dentro do mesmo pico). Os benefícios para o controle da qualidade da proteína e a caracterização biofísica fundamental são aparentes.

A verificação da ausência de particulados é bastante importante para medições sensíveis e repetíveis da SEC-MALS. Os picos de partículas geralmente aparecem como grandes sinais MALS desacompanhados por sinais UV ou RI comparáveis. A fase móvel e a amostra devem ser preparadas com cuidado para eliminar tais partículas. Uso de reagentes da HPLC-classe ou melhor, filtração da fase móvel e tampão da diluição a 0,1-0,2 μm (pre-washing o filtro para eliminar as partículas que estão sempre atuais em membranas secas), a manutenção de frascos móveis extra-limpos da fase e outros produtos vidreiros para SEC-MALS e equilibração de coluna estendida fluxo (para remover partículas e agregados que podem ter acumulado quando o fluxo foi interrompido ou uma coluna não em uso) são todos recomendados. A amostra deve ser filtrada para o menor tamanho de poros que não remove o material de interesse, geralmente não maior que 0,1 μm e, se possível, 0, 2 μm. Se o filtro obstrui rapidamente, a amostra pode ser centrifugada, filtrada em estágios do tamanho descendente do poro, e/ou re-purified. Quando os sistemas são mantidos consistentemente com a fase móvel de alta qualidade, fresca e filtrada, os choques da coluna são prevenidos, as amostras são limpas e não aderem à coluna, as medidas não exibirão o ruído particulado acima mencionado e fornecerão dados de alta qualidade.

MALS é agnóstico aos bufferes típicos da SEC para proteínas; muitos outros sistemas do amortecedor além de PBS podem ser usados para aperfeiçoar a separação e a estabilidade, incluindo uma variedade de excipientes⁷¹. MALS também é agnóstico para a coluna específica, que deve ser selecionado para a separação ideal e recuperação. As principais preocupações para os excipientes em relação à análise são alterações significativas no índice de refração, levando à modificação do incremento do índice de refração específico DN/DC, e excipientes que absorvem 280 nm quando a análise UV é necessária. Por exemplo, a arginina é um excipiente de redução de agregação comum que pode afetar drasticamente o DN/DC de uma proteína típica, mesmo trazendo-o para o regime negativo (uma proteína com DN/DC negativo ainda pode ser analisada por SEC-mals se DN/ DC é determinada empiricamente, mas se DN/DC = 0 a intensidade da luz dispersa pela proteína será nula e a análise de MW será impossível). O tópico de valores de DN/DC para proteínas é discutido extensivamente por Zhao et al.³⁵ onde se mostra que para buffers aquosos padrão, a grande maioria das proteínas não modificadas cai dentro de 2-3% do valor padrão (0,185 ou 0,186 ml/g em = 660 nm) , embora as proteínas abaixo de ~ 10 kDa são mais variáveis, e há algumas espécies que podem ir tão alto quanto 0,21 mL/g.

Os perfis de MW em todo o monômero BSA e os picos de dímero nos dados apresentados foram ambos bastante homogêneos para dentro de 2% ou menos, indicando espécies monodispersa. Valores de MW não uniformes em um pico podem surgir de heterogeneidade ou análise inadequada. Em particular, um perfil de BSA MW que é côncavo (‘ sorriso ‘) ou convexo (‘ careta ‘) pode resultar de não aplicar corretamente a correção de ampliação de banda. Para outras proteínas, um perfil convexo também pode surgir do equilíbrio dinâmico entre monómeros e oligomers, onde a proporção de monómero para Oligomer-e, portanto, o valor aparente de MW-depende da concentração de pico (BSA não apresenta esse comportamento e é freqüentemente usado como uma amostra de controle para verificar os parâmetros de ampliação da banda correta). Um perfil de MW que varia do que conduz à borda de arrasto e não muda com concentração da amostra é típico de uma distribuição das espécies do peso molecular que são resolvidas parcialmente por SEC. o equilíbrio dinâmico é prontamente distinguido do outro fontes de distribuições aparentemente inhomogêneas injetando diferentes quantidades totais de proteína-a distribuição variará com o equilíbrio dinâmico, mas não com uma distribuição fixa ou correção de ampliação de banda incorreta.

Dadas as restrições descritas acima, SEC-MALS não é adequado para várias tarefas. Não é adequado para análise de amostras brutas; as amostras devem ser bem purificadas por métodos de afinidade e polimento padrão. Ele não tem precisão suficiente ou poder de resolução para identificar mutantes e variantes de uma proteína ou MAB com massa mesmo ou muito próximo, e não pode ser usado com analitos que não eluir de ou separado em uma coluna SEC, embora recentemente foi demonstrado que Ion-Exchang e ou a cromatografia de fase reversa pode ser combinada com mals para separar e caracterizar as espécies que não são resolvidas pela SEC⁷²^,⁷³^,⁷⁴. Quando as quantidades de proteínas são severamente restritas, SEC-MALS pode não ser viável, uma vez que normalmente requer 10-200 μg³ e ainda mais pode ser exigido por um sistema FPLC com diâmetro interno da tubulação maior do que 0,25 mm; no entanto, quantidades menores podem ser analisadas por UHPLC-SEC-MALS. Proteínas altamente instáveis que agregam após a introdução à fase móvel não são adequadas para análise de SEC-MALS, embora a otimização de buffer usando dispersão de luz dinâmica off-line pode superar esse problema⁷⁵.

Apesar do esforço adicional que a SEC-MALS implica, é inestimável para a pesquisa proteica e é amplamente utilizado pelas comunidades acadêmicas e biofarmacêuticas. Além da caracterização de monómeros, oligômeros e agregados conforme descrito no protocolo acima, a SEC-mals pode caracterizar proteínas modificadas como glicoproteínas (determinando o MW dos componentes de proteína e glicina individualmente), surfactante-ou proteínas de membrana lipídica solubilizada (determinando o MW dos componentes protéico e solubilizante individualmente), conjuntos proteicos como partículas semelhantes a vírus, proteínas-proteínas e complexos de ácidos nucleicos de proteínas, polissacarídeos, conjugados de proteína-polissacárido, peptídeos e muitas outras biomacromoléculas.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos ao Dr. Tsafi Danieli (centro Wolfson para a biologia estrutural aplicada, Universidade Hebraica) para aconselhamento e colaborações. Agradecemos também a Daniel Biotech Ltd. (Rehovot, Israel) pela assistência e estabelecimento do sistema analítico FPLC-MALS utilizado neste estudo.

Materials

AKTA pure	GE Healthcare	29-0182-26	fast protein liquid chromatograph (FPLC)
AKTA UNICORN	GE Healthcare		FPLC control software
ASTRA	Wyatt Technology		MALS data acquisition and analysis software
Bovine serum albumine (purity >97%)	Sigma	A1900	analyte
DAWN or miniDAWN	Wyatt Technology	WH2 or WTREOS	multi-angle light scattering (MALS) detector
Increase 200 10/300	GE Healthcare		size exclusion column, 200 Å pores, 10 mm i.d., 300 mm length
Optilab	Wyatt Technology	WTREX	differential refractive index (RI) detector
Sodium chloride NaCl	Sigma	71382	HPLC grade NaCl
Stericup bottle top filter polyether sulfone 0.1 µm 1000 mL	Millipore	SCVPU11RE	mobile phase filter
Whatman Anotop 10 syringe filter 0.02 µm	GE Healthcare	6809-1002	sample filter
Whatman Anotop 10 syringe-tip filter, 0.1 µm pore, 10 mm diameter	GE Healthcare	6809-1012	sample filter
Whatman Anotop 25 syringe filter 0.1 µm	GE Healthcare	6809-2012	mobile phase filter
WyattQELS	Wyatt Technology	WIQ	dynamic light scattering detector

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Some, D., Amartely, H., Tsadok, A., Lebendiker, M. Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS). J. Vis. Exp. (148), e59615, doi:10.3791/59615 (2019).

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