Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Daniel Some; Hadar Amartely; Ayala Tsadok; Mario Lebendiker

doi:10.3791/59615

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Biochemistry

Caracterización de proteínas por cromatografía de exclusión de tamaño acoplada a dispersión de luz multiángulo (SEC-MALS)

Published: June 20, 2019

doi:

10.3791/59615

Daniel Some¹, Hadar Amartely², Ayala Tsadok³, Mario Lebendiker²

¹Wyatt Technology Corporation, ²Wolfson Centre for Applied Structural Biology, The Alexander Silberman Institute of Life Science,The Hebrew University of Jerusalem, ³Danyel Biotech Ltd.

Summary

Este protocolo describe la combinación de cromatografía de exclusión de tamaño con dispersión de luz multiángulo (SEC-MALS) para la caracterización absoluta de proteínas y complejos en solución. SEC-MALS determina el peso molecular y el tamaño de proteínas puras, oligómeros nativos, heterocomplejos y proteínas modificadas como glicoproteínas.

Abstract

La cromatografía analítica de exclusión de tamaño (SEC), comúnmente utilizada para la determinación del peso molecular de proteínas y complejos proteínas-proteínas en solución, es una técnica relativa que se basa en el volumen de elución del analito para estimar el Peso. Cuando la proteína no es globular o sufre interacciones de columna no ideales, la curva de calibración basada en estándares de proteína no es válida, y el peso molecular determinado a partir del volumen de elución es incorrecto. La dispersión de luz multiángulo (MALS) es una técnica absoluta que determina el peso molecular de un analito en solución a partir de ecuaciones físicas básicas. La combinación de SEC para la separación con MALS para el análisis constituye un medio versátil y confiable para caracterizar las soluciones de una o más especies de proteínas, incluidos monómeros, oligómeros o agregados nativos, y heterocomplejos. Dado que la medición se realiza en cada volumen de elución, SEC-MALS puede determinar si un pico de elución es homogéneo o heterogéneo y distinguir entre una distribución de peso molecular fija frente al equilibrio dinámico. También es posible el análisis de proteínas modificadas como glicoproteínas o lipoproteínas, o conjugados como las proteínas de membrana sofilizadas con detergente. Por lo tanto, SEC-MALS es una herramienta crítica para el químico proteico que debe confirmar las propiedades biofísicas y el comportamiento de la solución de las moléculas producidas para la investigación biológica o biotecnológica. Este protocolo para SEC-MALS analiza el peso molecular y el tamaño de los monómeros y agregados de proteínas puras. Los datos adquiridos sirven como base para nuevos análisis SEC-MALS, incluidos los de complejos, glicoproteínas y proteínas de membrana unidas a surfactantes.

Introduction

El análisis fiable del peso molecular (MW) de las proteínas en solución es esencial para la investigación biomolecular¹^,²^,³^,⁴. El análisis MW informa al científico si se ha producido la proteínacorrecta y si es adecuada para su uso en la experimentación posterior 5,⁶. Como se describe en los sitios web de las redes de investigación proteica P4EU⁷ y ARBRE-Mobieu⁸, el control de la calidad de las proteínas debe caracterizar no sólo la pureza del producto final, sino también su estado oligomérico, homogeneidad, identidad, conformación, estructura, modificaciones posteriores a la traducción y otras propiedades.

La medición de MW en solución no desnaturalizante identifica la forma de la proteína que está presente en un entorno acuoso, ya sea monomérico u oligomérico. Mientras que para muchas proteínas el objetivo es producir la forma monomérica, para otros un oligómero nativo específico es clave para la actividad biológica⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹². Otros oligómeros y agregados no nativos son indeseables y darán lugar a defectos en la determinación estructural por cristalografía, resonancia magnética nuclear (RMN) o dispersión de rayos X de ángulo pequeño, así como artefactos o imprecisiones en ensayos funcionales cuantificar la unión por calorimetría de valoración isotérmica o resonancia de plasmón superficial²^,¹³.

En el caso de bioterapias como los anticuerpos monoclonales (mAbs), el análisis de MW basado en soluciones tiene un propósito similar de control de calidad y caracterización del producto. Los agregados y fragmentos excesivos son indicativos de un producto inestable que no es adecuado para uso humano. Los organismos reguladores requieren una caracterización cuidadosa, no sólo de la molécula terapéutica, sino también de los posibles degradantes que pueden estar presentes en el producto final¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷.

Algunos de los métodos más extendidos para analizar la proteína MW son la electroforesis de gel de poliacrilamida de dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE), la electroforesis capilar (CE), la PAGE nativa, la espectrometría de masas (MS), la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) y la analítica ultracentrifugación (AUC). De estos, SDS-PAGE, CE y MS no se realizan en el estado nativo y normalmente conducen a la disociación de oligómeros y agregados, por lo tanto no son adecuados para determinar el oligómero nativo o cuantificar agregados. Aunque PAGE nativo, teóricamente, conserva el estado nativo, en nuestra experiencia es difícil optimizar para muchas proteínas, y los resultados no son muy confiables. AUC, ya sea por velocidad de sedimentación o equilibrio de sedimentación, es cuantitativo y puede determinar MW a partir de los primeros principios, pero es bastante engorroso, que requiere mucha mano de obra manual y experiencia significativa en la interpretación de datos, un largo tiempo de experimento y un instrumento muy caro.

La SEC analítica es un método cuantitativo y relativamente robusto y sencillo que separa las macromoléculas durante el flujo a través de una columna empaquetada. Los principios y aplicaciones de la SEC están bien presentados en varios exámenes¹⁸^,¹⁹^,²⁰ y en el manual “Cromatografía de Exclusión de Tamaño: Principios y Métodos”²¹. Las diferencias en la retención se deben a diferentes cantidades de tiempo dedicado a la difusión dentro y fuera de los poros en la fase estacionaria antes de eludar desde el final de la columna. Las diferencias surgen (nominalmente) de los tamaños relativos y coeficientes de difusión de las moléculas²². Una curva de calibración se construye utilizando una serie de moléculas de referencia, relacionando el MW de la molécula con el volumen de elución. En el caso de las proteínas, las moléculas de referencia son generalmente bien comportadas, proteínas globulares que no interactúan con la columna a través de la carga o residuos de superficie hidrófoba. El volumen de elución se mide con un detector de absorbancia ultravioleta (UV). Si el coeficiente de extinción UV se conoce a menudo calculado a partir de la secuencia, la masa total máxima de la proteína también puede ser cuantificada.

En particular, el análisis de MW por SEC se basa en dos supuestos clave con respecto a las proteínas a caracterizar: 1) comparten con las normas de referencia la misma conformación y volumen específico (en otras palabras, la misma relación entre las propiedades de difusión y MW) y 2) al igual que las normas de referencia, no interactúan con la columna excepto por propiedades legales,no se adhieren al embalaje de la columna por carga o interacciones hidrofóbicas. Las desviaciones de estos supuestos invalidan la curva de calibración y conducen a determinaciones erróneas de MW. Este es el caso de las proteínas intrínsecamente desordenadas que tienen grandes radios Stokes debido a sus extensas regiones no estructuradas^23,²⁴ o conjuntos oligoméricos no esféricos/lineales^10. Las proteínas glicosiladas generalmente tendrán un radio Stokes más grande que la forma no glucosilada, incluso cuando se tenga en cuenta la masa de carbohidratos añadida¹⁹. Las proteínas de membrana solubibilizadas detergente eluyen de manera diferente que las proteínas de calibración porque su elución de SEC depende del tamaño total del complejo de polipéptidos-detergentes-lípidos en lugar del estado oligomérico y la masa molar de la proteína²⁵ ^,²⁶. La química de las columnas, el pH y las condiciones de sal afectan todos los volúmenes de elución de proteínas con residuos de superficie cargados o hidrofóbicos^27,²⁸.

SEC se vuelve mucho más versátil y fiable para la determinación de MW cuando se combina con detectores de dispersión de luz multiángulo (MALS) e índice diferencial de refracción (dRI)³^,⁴^,¹¹^,²⁹^, ³⁰^,³¹^,³². Un detector dRI determina la concentración en función del cambio en el índice de refracción de la solución debido a la presencia del analito. Un detector MALS mide la proporción de luz dispersa por un analito en múltiples ángulos en relación con el rayo láser incidente. Conocida colectivamente como SEC-MALS, esta instrumentación determina el MW independientemente del tiempo de elución, ya que el MW se puede calcular directamente a partir de los primeros principios utilizando la Ecuación 1,

①

donde M es el peso molecular del analito, R(0) la relación reducida con Rayleigh (es decir, la cantidad de luz dispersada por el analito en relación con la intensidad del láser) determinada por el detector MALS y extrapolada al ángulo cero, c el concentración de peso determinada por el detector UV o dRI, dn/dc el incremento del índice de refracción del analito (esencialmente la diferencia entre el índice de refracción del analito y el búfer), y K una constante óptica que depende de la propiedades del sistema, como la longitud de onda y el índice de refracción de disolvente²⁹.

En SEC-MALS, la columna SEC se utiliza únicamente para separar las diversas especies en solución para que entren en las células del detector de concentración y MALS individualmente. El tiempo de retención real no tiene importancia para el análisis, excepto en cuanto a lo bien que resuelve las especies de proteínas. Los instrumentos se calibran independientemente de la columna y no se basan en normas de referencia. Por lo tanto, SEC-MALS se considera un método “absoluto” para la determinación de MW a partir de ecuaciones físicas básicas. Si la muestra es heterogénea y no está completamente separada por la columna, entonces el valor proporcionado en cada volumen de elución será un promedio de peso de las moléculas en cada volumen de elución que fluye a través de la celda de flujo por segmento de tiempo, aproximadamente 75 L.

Mediante el análisis de la variación angular de la intensidad de dispersión, MALS también puede determinar el tamaño (radio medio-cuadrado raíz, R_g) de macromoléculas y nanopartículas con un radio geométrico mayor que aproximadamente 12,5 nm²⁹. Para especies más pequeñas como proteínas monoméricas y oligómeros, se puede añadir un módulo de dispersión de luz dinámica (DLS) al instrumento MALS para medir los radios hidrodinámicos a partir de 0,5 nm y hasta³³.

Mientras que el análisis de concentración UV o dRI puede proporcionar el valor de c en Eq. 1, se prefiere el uso de dRI por dos razones: 1) dRI es un detector de concentración universal, adecuado para analizar moléculas como azúcares o polisacáridos que no contienen un UV cromóforo³⁴; y 2) la respuesta de concentración dn/dc de casi todas las proteínas puras en tampón acuoso es la misma dentro de uno o dos por ciento (0.185 mL/g)^35,por lo que no hay necesidad de conocer el coeficiente de extinción UV.

El uso de SEC-MALS en la investigación proteica es bastante extenso. Con mucho, las aplicaciones más comunes son establecer si una proteína purificada es monomérica u oligomérica y el grado de oligomerización, y evaluar los agregados³^,¹⁰^,¹¹^,¹⁷^, ³¹^,³⁶^,³⁷^,³⁸. La capacidad de hacerlo para las proteínas de membrana sóloubicadas con detergente que no pueden caracterizarse por medios tradicionales es especialmente apreciada, y se han publicado protocolos detallados para ello^31,^39,⁴⁰ ^, ⁴¹ ^, ⁴² ^, ⁴³. Otras aplicaciones comunes incluyen el establecimiento del grado de modificación post-traduccional y polidispersidad de glicoproteína, lipoproteínas y conjugados similares⁴^,³¹^,⁴⁴ ^, ⁴⁵ ^, ⁴⁶ ^, ⁴⁷; la formación (o falta de ella) y la estequiometría absoluta (a diferencia de la relación estequiométrica) de heterocomplejos, incluidos los complejos proteína-proteína, ácido proteico-nucleico y proteína-polisacárido²⁴^,⁴⁶^, ⁴⁸^,⁴⁹^,⁵⁰^,⁵¹^,⁵²; determinar la constante de disociación monomero-dímero⁴⁹^,⁵³^,⁵⁴; y evaluar la conformación proteica⁵⁵^,⁵⁶. Más allá de las proteínas, SEC-MALS es invaluable para la caracterización de péptidos⁵⁷^,⁵⁸, polímeros naturales ampliamente heterogéneos como heparinas⁵⁹ y quitosanses⁶⁰^,⁶¹, pequeños virus⁶² y la mayoría de los tipos de polímeros sintéticos o procesados^63,^64,⁶⁵^,⁶⁶. Una extensa bibliografía se puede encontrar en la literatura⁶⁷ y en línea (a http://www.wyatt.com/bibliography).

Aquí, presentamos un protocolo estándar para ejecutar y analizar un experimento SEC-MALS. La albúmina sérica bovina (BSA) se presenta como un ejemplo para la separación y caracterización de monómeros y oligómeros proteicos. El protocolo BSA determina ciertas constantes del sistema que sirven como base para nuevos análisis SEC-MALS, incluidos los de complejos, glicoproteínas y proteínas de membrana unidas a surfactantes.

Observamos que se puede realizar SEC-MALS utilizando un equipo estándar de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) o cromatografía líquida de proteína rápida (FPLC) de muchos proveedores. Este protocolo describe el uso de un sistema FPLC que se encuentra comúnmente en laboratorios que producen proteínas para investigación y desarrollo (ver Tabla de Materiales). Antes de ejecutar el protocolo, el sistema FPLC, los detectores MALS y dRI deberían haber sido instalados, junto con sus respectivos paquetes de software para el control, la adquisición y el análisis de datos según las instrucciones del fabricante y cualquier constante de calibración requerida u otros ajustes introducidos en el software. Se debe colocar un filtro en línea entre la bomba y el inyector con una membrana hidrofílica de poros de 0,1 m instalada.

Protocol

1. Preparación del sistema Conecte los detectores MALS y dRI aguas abajo del detector UV del FPLC. Evite los detectores de pH y conductividad, ya que añadirán un volumen interdetector significativo entre los detectores UV y MALS. Utilice tubos capilares de 0,25 mm i.d. desde la columna hacia y entre los detectores, y tubos capilares de 0,75 mm i.d. en la salida de los detectores a residuos o colector de fracciones. Asegúrese de que se han establecido las conexiones de señal necesarias entre el FPLC y los detectores, incluida la salida analógica desde el detector UV a la entrada analógica MALS, y la salida digital desde el FPLC hasta la MalS Autoinject, a través de la caja de E/S del FPLC. Instale una columna SEC analítica adecuada que cubra un rango de fraccionamiento de al menos 20 kDa a 500 kDa. Compruebe la información del producto para determinar si la columna es adecuada para el rango de MW, pH y otras propiedades de la fase de muestra y móvil. 2. Preparación del buffer, f exuberante el sistema durante la noche y comprobar la limpieza Usando reactivos de grado HPLC, prepare 1 L de solución salina con fosfato con 50 – 100 mM de NaCl. Filtre el tampón a 0,1 m utilizando un filtro de sulfona de poliéter superior a la botella o similar. Filtrar los primeros 50-100 ml de tampón a una botella de desecho y desechar, con el fin de eliminar las partículas de los filtros secos, y luego filtrar el resto a una botella limpia y estéril que ha sido lavada a fondo con agua filtrada y desionizada y tapada para evitar polvo de entrar.NOTA: Se pueden utilizar otros disolventes de fase móvil, como un tampón Tris, si se deben analizar proteínas adicionales que se disuelven preferentemente en esos disolventes. Lavar durante la noche a un caudal de 0,5 ml/min, o según lo recomendado por el fabricante de la columna, para equilibrar la columna en el búfer y eliminar las partículas. Utilice el modo de flujo continuo del FPLC y asegúrese de que el flujo no se detenga hasta que se completen todas las ejecuciones SEC-MALS. Coloque la celda de flujo dRI en modo Purga durante el vaciado nocturno. Desactive la purga antes de que se ejecute el ejemplo inicial. Al comenzar el lavado, gradualmente aumenta el caudal para evitar el efecto de “desprendimiento de columna” (o liberación de partículas) causado por un cambio repentino de presión en la columna. Si se sabe que el sistema es bastante estable y libre de partículas, y en equilibrio con la fase móvil deseada, reemplace el lavado nocturno por un lavado más corto de 2-3 h. Compruebe la limpieza del sistema tocando ligeramente el tubo aguas abajo de la columna para liberar las partículas acumuladas y observando la señal en el detector de 90o en la pantalla del panel frontal del instrumento MALS. Verifique que el ruido de pico a pico no sea más de 50 -100 V. Realice una inyección en blanco para verificar que el inyector está limpio de partículas. Un “blanco” es simplemente el tampón de carrera, preparado en un vial fresco y estéril. Si el pico de partícula no tiene más de 1 ml de volumen y no más de 5 ml por encima de la línea de base, el sistema está listo para muestras. De lo contrario, realice inyecciones adicionales en blanco hasta que estén limpios o realice tareas de mantenimiento para limpiar el inyector. 3. Preparación y carga de la muestra Preparar al menos 200 l de BSA a 1-2 mg/ml en el búfer SEC.NOTA: Para evitar precipitaciones, BSA nunca debe disolverse en agua pura. Filtrar la proteína a 0,02 m utilizando un filtro de punta de jeringa. Deseche las primeras gotas de filtrado para eliminar las partículas de los filtros secos. Alternativamente, centrifugar la muestra a 10.000 x g durante 15 minutos para permitir la precipitación de agregados no solubles y otras partículas grandes. Inyecte 100 l de la solución de BSA en el bucle.NOTA: Esta es la cantidad recomendada de material, y más o menos se puede inyectar de acuerdo con las circunstancias de la muestra, como la estabilidad o la disponibilidad. La cantidad de proteína requerida por inyección varía inversamente con el peso molecular – el doble de masa proteica se necesita si el peso molecular es de 33 kDa, o la mitad de la de BSA. 4. Preparación del software MALS Abrir nuevo ? Experimente desde Método en el menú del software MALS y seleccione el método Online en la carpeta Métodos del sistema de dispersión de luz. Si hay un detector de DLS presente, seleccione el método Online en la dispersión de luz . Con la carpeta QELS. En la sección Configuración, establezca los parámetros de la fase de muestra y móvil. En la vista Bomba genérica, establezca el caudal en el utilizado en el FPLC. En la vista Bomba genérica, rama Disolvente, campo Nombre, seleccione PBS. En la vista Inyector, Rama de muestra, escriba el Nombre como BSAy establezca dn/dc a 0,185 (el valor estándar para las proteínas no modificadas), A2 a 0 y coeficiente de extinción UV a 0,667 ml/(mg-cm).NOTA: Para otras proteínas, el coeficiente de extinción UV280 nm puede encontrarse en la literatura o calcularse a partir de su secuencia utilizando varias herramientas de software de dominio público. En la sección Procedimientos, vista Colección básica, active la casilla Desencadenador en Autoinyección y establezca la duración de la ejecución en 70 min para que se recopilen datos para toda la elución hasta el volumen de permeación total de la SEC columna se alcanza.NOTA: La cantidad de tiempo necesaria puede variar con la columna y el caudal – 35 minutos de recolección son necesarios para una columna estándar de 7,8 mm x 300 mm HPLC-SEC a 0,5 ml/min. Inicie el experimento en el software MALS haciendo clic en el botón Ejecutar. Comenzará a leer los datos después de recibir la señal de pulso del instrumento FPLC a través del detector MALS. Cero la señal dRI haciendo clic en el botón Autozero en el panel frontal del instrumento. 5. Preparación del software FPLC Inserte el nombre de la proteína y la ejecución en el software FPLC, en Manual ( Manual) Ejecutar las instrucciones manuales ? Establecer marca. Cambie la válvula de inyección de Carga manual a Inyectar en Ruta de flujo . Válvula de inyección. Incluya una señal de pulso insertando un pulso de 0,5 s en la caja de E/S. Pulse digital out. Esto desencadenará la recopilación de datos en el software MALS. 6. Inyecte la muestra en el bucle. Haga clic en Ejecutar en el software FPLC para iniciar la ejecución del experimento. 7.Análisis de los datos de SEC-MALS BSA Realice el análisis, paso a paso, en la sección Procedimientos del software MALS. Compruebe que aparecen picos, aproximadamente en el mismo volumen de elución en UV, MALS y RI, comprobando la vista Colección básica. En la vista línea base, defina la línea base para todas las señales (todos los detectores LS, UV y dRI). Las líneas de base deben definirse para indicar el nivel de disolvente puro, que estiran preferentemente de un lado de los picos de la muestra al otro. En la vista Picos, defina los picos que se analizarán haciendo clic y arrastrando el ratón. Seleccione el 50% central de cada pico. Primero seleccione el pico del monómero (‘Peak 1’) y luego el pico dimer (‘Peak 2’). Verificar los valores correctos de dn/dc a 0,185 y del coeficiente de extinción UV 280 nm a 0,667 para BSA bajo cada pico. Realice procedimientos de alineación de picos, corrección de ampliación de bandas y normalización.NOTA: Normalmente, el método SEC-MALS se calibra periódicamente para la alineación de picos, el ensanchamiento de bandas y la normalización de los detectores angulares al detector de 90o utilizando una proteína monodispersa con radio de giro Rg < 10 nm como BSA Monómero. En este ejemplo, BSA sirve tanto como la molécula de calibración y es en sí misma el tema del análisis de MW. En los procedimientos de la aplicación de la Vista de alineación, seleccione la región central de los picos haciendo clic y arrastrando el ratón, haga clic en Alinear señales y, a continuación, en Aceptar. En los procedimientos de la aplicación de la Vista de ampliación de banda, elija el 50% central del pico de monómero. Asegúrese de que el detector RI se especifica como el instrumento de referenciay, a continuación, haga clic en Realizar ajuste y aplicar para que coincida con las señales UV y LS con la señal RI. Acérquese a los picos para verificar que se superponen muy de cerca dentro del 50-70% central y, a continuación, haga clic en Aceptar. Si la superposición no es perfecta, (puede ser necesario) realizar el ajuste y “Aplicar” una o dos veces más hasta que la superposición sea excelente. En los procedimientos de la aplicación de la Vista de normalización, seleccione Pico 1, escriba 3,0 nm como valor R g, haga clic en Normalizar y, a continuación, en Aceptar. En los procedimientos de la aplicación de la Masa molar y Rg de la vista MALS, revise los datos para determinar cuáles, si los hay, se deben deseleccionar los ángulos de detección del análisis debido al ruido excesivo. Típicamente, estos serán los ángulos inferiores en los que las partículas de polvo dispersan una intensidad relativamente alta. Seleccione sectores individuales dentro de los picos del gráfico de la derecha y vea la dependencia angular de la relación inversa de Rayleigh reducida en el gráfico de la izquierda. Si los ángulos más bajos (y a veces los más altos) se desvían en gran medida del ajuste, anule la selección de la lista en la parte inferior de la vista. Vea el gráfico de los resultados en la vista Gráfico de EASI. Seleccione Masa molar en el menú desplegable Visualización en la parte superior de la ventana. Utilice Ctrl + clic y arrastre para acercar la región de pico. Ver los resultados finales de la masa molar media de peso tabulado para los picos de monómero y dimer en los Resultados de la Vista de informe (resumen) en Resultados máximos ( Peak Results) Momentos de masa molar (g/mol) Mw. La pureza se informa en Resultados de pico Fracción de masa (%).NOTA: También se muestran otros momentos de masa molar; generalmente son relevantes para polímeros heterogéneos, pero no para proteínas con tamaños discretos. Muchos otros resultados producidos por el software pueden incluirse en el informe, como el porcentaje de recuperación de masa (la fracción de proteína que eluyó a través del detector de concentración en relación con la cantidad inyectada), estadísticas de pico, polidispersidad, Rg y Rh momentos, etc. Cuando se proporcionan, las medidas de incertidumbre reflejan la precisión del valor citado en función del ruido dentro de la serie de medición y no deben considerarse que representan la precisión. La verdadera precisión de los valores notificados depende de varios factores, como la precisión de los valores de coeficiente de extinción y dn/dc proporcionados, calibración del instrumento, etc. En el menú Archivo, seleccione Guardar como método y guarde los datos BSA analizados como un método estándar para futuras mediciones de todos los tipos de proteínas. Los parámetros de normalización y ampliación de bandas determinados para BSA se transferirán en el análisis.

Representative Results

La Figura 1a,b muestra que tres formas oligoméricas de BSA: monómero, dimero y recortador, estaban bien separadas en la columna de poros de 200o con resolución de línea de base de monómero y dimer, mientras que la Figura 2a muestra que la separación en una columna de poro de 75o no lograr una buena resolución monomero-dimer. Este último ejemplo se incluyó para ilustrar un resultado “pobre”; estas diferencias de separación para las dos columnas pueden, de hecho, esperarse de acuerdo con los rangos de separación indicados por el fabricante. El recortador no está completamente separado del dimer y los oligómeros más altos no están bien separados del trimer y entre sí. La Figura 2b es un ejemplo de señal de dispersión de luz ruidoso con partículas presentes en todo el cromatograma, lo que impide una determinación precisa de MW. A partir de ahora nos centramos en la Figura 1b. El monómero, que eluyó a 13,8 ml, exhibe una masa molar media de peso Mw de 64,1 x 0,4 kDa determinada por MALS y radio hidrodinámico Rh de 3,54 x 0,01 nm. Estos resultados están de acuerdo con la masa de secuencia y el radio hidrodinámico conocido de BSA, 66,4 kDa y 3,5 nm respectivamente68,a la precisión habitual de SEC-MALS, 5%3,69. El dimer, que eluyó a 12 ml, exhibió un valor de Mw de 127 x 1 kDa determinado por MALS-como se esperaba, el doble que el monómero a dentro de la precisión experimental-y Rh de 5.68 a 0.06 nm. El pico del recortador también se observó a 11 ml con Mw de 194 x 9 kDa determinado por MALS, tres veces el del monómero a dentro de la precisión experimental, como se esperaba. R h del trimer no pudo determinarse debido a la baja intensidad de la señal DLS. Los puntos de masa molar calculados a lo largo del pico del monómero son uniformes dentro del 2-5%, lo que indica homogeneidad. No es raro encontrar un hombro arrastrado con masa molar en el rango de 38-50 kDa, correspondiente a fragmentos de BSA70. Los puntos de masa molar a través de los picos dimericos y triméricos no son uniformes, indicativos de la heterogeneidad. El pico dimer es algo heterogéneo debido a los rastros de trimer que se desangran en el pico dimer, y el pico del recortador es heterogéneo debido a la co-elución de los oligómeros superiores mal resueltos. El nivel de señal a ruido del pico del monómero es bastante aceptable en las tres señales, sobre 100:1, al igual que el pico dimer con señal a ruido de 40:1. Las regiones de cromatograma más allá de los picos proteicos son planas, con las excepciones de un pico debido a partículas cerca del volumen de exclusión total (vacío) en la traza LS y un pico de sal (positivo) y un pico de aire disuelto (negativo) en el rastro de dRI, cerca de la permeación total Volumen. Estos se señalan en la Figura 1a. El nivel de pureza también se puede calcular en un experimento SEC-MALS: la fracción de masa del pico monomérico en el informe representa el porcentaje de pureza de la forma monomérica. Para el monómero BSA, la pureza calculada es del 88%. Figura 1 : Análisis SEC-MALS de albúmina sérica bovina (BSA) utilizando una columna de exclusión de tamaño de poro de 200o. Las trazas de cromatograma se normalizan al pico del monómero y se compensan para mayor claridad. (A) Se señalan los artefactos comunes que pueden ser ignorados, incluyendo un pico de partícula cerca del comienzo de la señal de dispersión de luz, así como picos de sal y aire disuelto cerca del volumen de permeación total en la señal de índice de refracción. (B) El cromatograma exhibe una excelente separación monómero-dimero-recortador y la señal de dispersión de luz exhibe una alta señal-ruido. Los valores de los MW monómeros y dimer presentan una alta homogeneidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2 : Ejemplos de análisis SEC-MALS de baja calidad. Las trazas de cromatograma se normalizan al pico del monómero y se compensan para mayor claridad. (A) Separación inadecuada en una columna de exclusión de tamaño de poro de 75o; un pico de partícula entre 8 – 9 min no está bien separado de las proteínas. (B) La relación señal-ruido inadecuada y las partículas extensas adyacentes a las proteínas son evidentes en la señal de dispersión de luz (LS). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

El experimento SEC-MALS ha proporcionado una buena separación de monómero, dimero y recortador, y resultados cuantitativos para las masas molares y los tamaños hidrodinámicos de cada pico. Esto a su vez identifica y caracteriza claramente cada especie presente, así como la cuantificación de la pureza. Por lo general, los resultados obtenidos son precisos dentro del 5%, y precisos y repetibles dentro de 1-2%³^,⁶⁹. Este nivel de precisión y repetibilidad permite distinguir con confianza entre las especies que pueden estar cerca en MW, siempre y cuando estén separadas por sec (pueden superponerse parcialmente dentro del mismo pico). Los beneficios para el control de la calidad de las proteínas y la caracterización biofísica fundamental son evidentes.

La verificación de la ausencia de partículas es muy importante para las mediciones sensibles y repetibles de SEC-MALS. Los picos de partículas generalmente aparecen como señales MALS grandes no acompañadas de señales UV o RI comparables. La fase móvil y la muestra deben prepararse cuidadosamente para eliminar dichas partículas. Uso de reactivos de grado HPLC o mejor, filtración de fase móvil y tampón de dilución a 0,1 – 0,2 m (prelavado del filtro para eliminar partículas que siempre están presentes en membranas secas), mantenimiento de botellas de fase móvil extralimpia dasluz y otros cristalería para Se recomienda el EQUILIBRIO de columnas SEC-MALS y de columnas extendidas bajo flujo (para eliminar partículas y agregados que pueden haberse acumulado cuando se detuvo el flujo o una columna que no está en uso). La muestra debe filtrarse al tamaño de poro más pequeño que no elimine el material de interés, por lo general no más de 0,1 m y, si es posible, 0,02 m. Si el filtro se obstruye rápidamente, la muestra puede ser centrifugada, filtrada en etapas de tamaño de poro descendente y/o re-purificada. Cuando los sistemas se mantienen consistentemente con fase móvil de alta calidad, fresca y filtrada, se evitan los choques de columna, las muestras están limpias y no se adhieren a la columna, las mediciones no mostrarán el ruido de partículas antes mencionado y proporcionarán datos de alta calidad.

MALS es agnóstico de los tampones TÍPICOs de SEC para proteínas; muchos otros sistemas de amortiguación además de PBS se pueden utilizar para optimizar la separación y la estabilidad, incluyendo una variedad de excipientes^71. MALS también es independiente de la columna específica, que debe seleccionarse para una separación y recuperación óptimas. Las principales preocupaciones de los excipientes con respecto al análisis son cambios significativos en el índice de refracción, lo que lleva a la modificación del incremento específico del índice de refracción dn/dc,y los excipientes que absorben 280 nm cuando se necesita análisis UV. Por ejemplo, la arginina es un excipiente reductor de agregación común que puede afectar dramáticamente el dn/dc de una proteína típica, incluso llevándola al régimen negativo (una proteína con dn/dc negativo todavía puede ser analizada por SEC-MALS si dn/ DC se determina empíricamente, pero si dn/dc a 0 la intensidad de la luz dispersada por la proteína será nula y el análisis de MW será imposible). El tema de los valores dn/DC para proteínas es discutido extensamente por Zhao et al.³⁵ donde se muestra que para los tampones acuosos estándar, la gran mayoría de las proteínas no modificadas caen dentro del 2-3% del valor estándar (0.185 o 0.186 mL/g a 660 nm) , aunque las proteínas por debajo de 10 kDa son más variables, y hay algunas especies que pueden llegar hasta 0,21 ml/g.

Los perfiles de MW en los picos de monómero y dimer de BSA en los datos presentados fueron bastante homogéneos en un 2% o menos, lo que indica que las especies monodispersas. Los valores de MW no uniformes a lo largo de un pico pueden surgir de heterogeneidad o análisis incorrectos. En particular, un perfil de MW de BSA cóncavo («sonrisa») o convexo (en lo que se trata de muecas) podría resultar de no aplicar correctamente la corrección de ampliación de banda. Para otras proteínas, un perfil convexo también podría surgir del equilibrio dinámico entre monómeros y oligómeros, donde la relación entre monómero y oligomero-y por lo tanto el valor mw aparente-depende de la concentración máxima (BSA no exhibe este comportamiento y se utiliza a menudo como una muestra de control para verificar los parámetros de ensanchamiento de banda correctos). Un perfil de MW que varía desde el que conduce al borde final y no cambia con la concentración de la muestra es típico de una distribución de especies de peso molecular que se resuelven parcialmente por la SEC. El equilibrio dinámico se distingue fácilmente de la otra las fuentes de distribuciones aparentemente inhomogéneas mediante la inyección de diferentes cantidades totales de proteínas- la distribución variará con el equilibrio dinámico, pero no con una distribución fija o una corrección incorrecta de ampliación de la banda.

Dadas las restricciones descritas anteriormente, SEC-MALS no es adecuado para varias tareas. No es adecuado para el análisis de muestras brutas; las muestras deben estar bien purificadas por métodos estándar de afinidad y pulido. No tiene suficiente precisión o poder de resolución para identificar mutantes y variantes de una proteína o mAb con la misma o muy cerca de masa, y no se puede utilizar con analitos que no eluden o se separan en una columna SEC, aunque recientemente se ha demostrado que el ion-exchang e o cromatografía de fase inversa se puede combinar con MALS para separar y caracterizar especies que no se resuelven con SEC^72,⁷³^,⁷⁴. Cuando las cantidades de proteínas están severamente restringidas, la SEC-MALS puede no ser factible, ya que normalmente requiere 10 – 200 g³ y incluso más puede ser requerida por un sistema FPLC con diámetro interior de tubo superior a 0,25 mm; sin embargo, UHPLC-SEC-MALS puede analizar cantidades más pequeñas. Las proteínas altamente inestables que se agregan al introducción a la fase móvil no son adecuadas para el análisis SEC-MALS, aunque la optimización del búfer mediante dispersión de luz dinámica fuera de línea puede superar este problema^75.

A pesar del esfuerzo adicional que implica SEC-MALS, es invaluable para la investigación proteica y es ampliamente utilizado por las comunidades académicas y biofarmacéuticas. Además de la caracterización de monómeros, oligómeros y agregados como se describe en el protocolo anterior, SEC-MALS puede caracterizar proteínas modificadas como glicoproteínas (determinando el MW de los componentes proteicos y glicanos individualmente), tensioactivos o proteínas de membrana sofibilizadas con lípidos (determinando el MW de los componentes de proteínas y solubilizadores individualmente), conjuntos de proteínas como partículas similares a virus, complejos de proteínas-proteínas y ácidos proteicos-nucleicos, polisacáridos, conjugados proteicos-polisacáridos, péptidos y muchas otras biomacromoléculas.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos al Dr. Tsafi Danieli (Centro Wolfson de Biología Estructural Aplicada, Universidad Hebrea) por su asesoramiento y colaboraciones. También agradecemos a Daniel Biotech Ltd. (Rehovot, Israel) la asistencia y el establecimiento del sistema analítico FPLC-MALS utilizado en este estudio.

Materials

AKTA pure	GE Healthcare	29-0182-26	fast protein liquid chromatograph (FPLC)
AKTA UNICORN	GE Healthcare		FPLC control software
ASTRA	Wyatt Technology		MALS data acquisition and analysis software
Bovine serum albumine (purity >97%)	Sigma	A1900	analyte
DAWN or miniDAWN	Wyatt Technology	WH2 or WTREOS	multi-angle light scattering (MALS) detector
Increase 200 10/300	GE Healthcare		size exclusion column, 200 Å pores, 10 mm i.d., 300 mm length
Optilab	Wyatt Technology	WTREX	differential refractive index (RI) detector
Sodium chloride NaCl	Sigma	71382	HPLC grade NaCl
Stericup bottle top filter polyether sulfone 0.1 µm 1000 mL	Millipore	SCVPU11RE	mobile phase filter
Whatman Anotop 10 syringe filter 0.02 µm	GE Healthcare	6809-1002	sample filter
Whatman Anotop 10 syringe-tip filter, 0.1 µm pore, 10 mm diameter	GE Healthcare	6809-1012	sample filter
Whatman Anotop 25 syringe filter 0.1 µm	GE Healthcare	6809-2012	mobile phase filter
WyattQELS	Wyatt Technology	WIQ	dynamic light scattering detector

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Some, D., Amartely, H., Tsadok, A., Lebendiker, M. Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS). J. Vis. Exp. (148), e59615, doi:10.3791/59615 (2019).

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