多角光散乱に結合したサイズ排除クロマトグラフィーによるタンパク質の特性化(SEC-MALS)

1. システムの準備 FPLCのUV検出器の下流にあるMALSとdRI検出器を接続します。それらは紫外線およびMALS検出器間の重要なインターテクタの容積を加えるのでpHおよび伝導性検出器をバイパスする。検出器との間のカラム間の0.25mm i.d.の毛細管チューブと、検出器の出力に0.75mm i.d.キャピラリーチューブを使用して、コレクターを無駄または分画コレクターにします。 FPLCと検出器の間に必要な信号接続が確立されていることを確認します, UV検出器からMALSアナログ入力へのアナログ出力, FPLCからMALSオートインジェクトへのデジタル出力, FPLCのI/Oボックスを介して. 少なくとも 20 kDa から 500 kDa の分数範囲をカバーする適切な分析 SEC カラムをインストールします。製品情報を調べて、カラムがサンプルおよびモバイルフェーズの MW、pH およびその他の特性の範囲に適しているかどうかを確認します。 2.バッファの準備、一晩システムを緑豊かで清潔度をチェック HPLCグレードの試薬を使用して、50~100mM NaClで1Lのリン酸緩衝生理食べ物を調製します。ボトルトップポリエッチャースルホンフィルターなどを使用して、バッファを0.1 μmにフィルタリングします。最初の50-100 mLのバッファーを廃ボトルに濾過し、廃棄し、乾燥フィルターから微粒子を除去し、残りを濾過された脱イオン水で十分に洗浄し、キャップした清潔な無菌ボトルに濾過し、防ぐためにキャップほこりが入る。注:トリスバッファーなどの他の移動相溶媒は、それらの溶媒に優先的に溶解される追加のタンパク質を分析する場合に使用されてもよい。 流量0.5 mL/minで一晩、またはカラムメーカーが推奨するように一晩フラッシュして、バッファー内のカラムを平衡化し、微粒子を除去します。FPLCの連続フローモードを使用し、すべてのSEC-MALSの実行が完了するまでフローが停止しないようにします。 dRI フロー セルを一晩のフラッシュ中にパージモードにします。サンプルの実行を開始する前にパージをオフにします。 フラッシュを開始するときは、カラムの圧力の急激な変化によって引き起こされる「カラム脱落」効果(または粒子の放出)を防ぐために、徐々に流量を傾斜させます。 システムが非常に安定し、粒子フリーであることが知られており、所望の移動相と平衡状態にある場合は、一晩のフラッシュを短い2-3 hフラッシュに置き換えます。 カラムの下流のチューブを軽くタップして蓄積された粒子を放出し、MALS機器のフロントパネルディスプレイ上の90°検出器で信号を観察することで、システムの清浄度を確認します。ピークツーピークノイズが50 -100 μV 以下であることを確認します。 「ブランク」インジェクションを実行して、インジェクタがパーティクルのクリーンであることを確認します。「ブランク」は、単に新鮮な、無菌バイアルで調製された実行中のバッファです。 パーティクルピークの体積が 1 mL 以下で、ベースラインより 5 mV 以下の場合、システムはサンプルの準備ができています。それ以外の場合は、クリーンになるまで追加のブランクインジェクションを実行するか、メンテナンスを実行してインジェクタをクリーニングします。 3. サンプルの準備と読み込み SECバッファー内の1-2 mg/mLでBSAの少なくとも200 μLを調製します。注:沈殿を防ぐために、BSAは純水に溶解してはなりません。 シリンジチップフィルターを使用してタンパク質を0.02 μmに濾過します。 乾燥したフィルターから粒子を除去するために濾液の最初の数滴を廃棄します。 あるいは、サンプルを10,000 x gで15分間遠心分離し、非可溶性凝集体およびその他の大きな粒子の沈殿を可能にする。 BSA溶液の100 μLをループに注入します。注:これは、材料の推奨量であり、安定性や可用性などのサンプルの状況に応じて多かれ少なかれ注入されてもよい。注射に必要なタンパク質の量は分子量によって逆に異なり、分子量が33kDa、またはBSAの半分の場合、タンパク質量の2倍が必要です。 4. MALSソフトウェアの準備 新規開き |MALSソフトウェアメニューの方法から実験し、光散乱システムメソッドフォルダからオンラインメソッドを選択します。DLS ディテクタが存在する場合は、光散乱からオンラインメソッドを選択します|QELS フォルダを使用します。 [構成]セクションで、サンプルフェーズとモバイル フェーズのパラメータを設定します。 汎用ポンプビューで、流量を FPLC で使用する流量に設定します。 [汎用ポンプ]ビューで、溶剤分岐、[名前]フィールドで、[PBS] を選択します。 インジェクタビューで、サンプルブランチをBSAとして入力し、dn/dc = 0.185(未修飾タンパク質の標準値)、A2 = 0、および UV消滅係数 = 0.667 mL/(mg-cm)を設定します。 注:他のタンパク質の場合、UV280 nm消滅係数は、文献に見出されるか、または様々なパブリックドメインソフトウェアツールを使用してその配列から計算される場合があります。 [手順] セクションの[基本コレクション]ビューで、[自動挿入のトリガー] チェック ボックスをオンにし、実行の継続時間を 70 分に設定して、SEC の透過量の合計まで溶出全体のデータが収集されます。 列に到達します。注:必要な時間はカラムと流量によって異なる場合があります – 0.5 mL/分の標準7.8 mm x 300 mm HPLC-SECカラムには35分の回収が必要です。 [実行] ボタンをクリックして、MALS ソフトウェアで実験を開始します。MALS検出器を介してFPLC機器からパルス信号を受信した後、データの読み取りを開始します。 計測器の前面パネルのオートゼロボタンをクリックして、dRI信号をゼロにします。 5. FPLCソフトウェアの準備 FPLC ソフトウェアにタンパク質の名前と実行の名前を取り込む |手動指示の実行 |マークを設定します。 注入弁を手動荷重からフローパスの下に注入に切り替える|注入弁。 I/O ボックスの下に 0.5 s パルスを挿入してパルス信号を含める|パルスデジタルアウト.これにより、MALS ソフトウェアのデータ収集がトリガーされます。 6. サンプルをループに注入します。[FPLC ソフトウェアで実行] をクリックして、実験実行を開始します。 7.SEC-MALS BSAデータの分析 MALS ソフトウェアの[手順]セクションの下で、分析をステップバイステップで実行します。 基本コレクションビューをオンにして、UV、MALS、RI の溶出体量とほぼ同じピークが表示されることを確認します。 ベースラインビューで、すべての信号(すべての LS 検出器、UV、および dRI)のベースラインを定義します。ベースラインは、純粋な溶媒のレベルを示すために定義されるべきで、サンプルピークの一方の側から他方への伸張が好ましい。 [ピーク]ビューで、マウスをクリックしてドラッグして解析するピークを定義します。各ピークの中心 50% を選択します。まず、モノマーピーク(「ピーク1」)を選択し、次にダイマーピーク(「ピーク2」)を選択します。dn/dc = 0.185 および UV 280 nm 消滅係数 = 各ピーク下の BSA の正しい値を確認します。 ピークアライメント、バンド広げ補正、正規化手順を実行します。注:通常、SEC-MALS法は、BSAのようなジャイレーションR g<10nmの半径を持つ単分散タンパク質を使用して、90°検出器への角検出器のピークアライメント、バンドの広がりおよび正規化のために定期的に校正される。モノマー。この例では、BSAはキャリブレーション分子の両方として機能し、それ自体がMW分析の対象です。 手順で|位置合わせビューは、マウスをクリックしてドラッグしてピークの中央領域を選択し、[信号の位置合わせ]をクリックし、[OK] をクリックします。 手順で|バンドの拡大ビューは、モノマーピークの中央50%を選択します。RIディテクタがリファレンスインストゥルメントとして指定されていることを確認し、[適合を実行]をクリックして、UV信号とLS信号をRI信号に合わせて適用します。 ピークにズームインして、中央の 50 ~ 70% 内で非常に密接に重なっていることを確認し、[OK] をクリックします。 オーバーラップが完璧でない場合は、フィットを実行し、オーバーラップが優れるまでさらに1~2回「適用」します。 手順で|[正規化]ビューで[ピーク 1]を選択し、R g値として 3.0 nm と入力し、[OK] をクリックします。 手順で|MALS ビューのモル質量と Rgを確認して、過度のノイズが原因で検出角度を解析から選択解除する必要がある場合は、データを確認します。典型的には、これらは、塵粒子が比較的高い強度を散乱する低い角度になります。右側のグラフからピーク内の個々のスライスを選択し、左側のグラフで逆減少レイリー比の角度依存を表示します。最も低い(時には最も高い)角度が一貫してフィットから大きくずれる場合は、ビューの下部にあるリストから選択を解除します。 結果のグラフをEASI グラフビューに表示します。ウィンドウの上部にある[表示]ドロップダウンから[モル質量]を選択します。Ctrl キーを押しながらクリックしてドラッグすると、ピーク領域を拡大表示できます。 結果のモノマーとダイマーのピークの最終的な表形式の重量平均モル質量結果を表示する |ピーク結果の下のレポート (サマリー) ビュー |モル質量モーメント (g/mol) |Mw.純度はピーク結果で報告 | 質量分数(%)注:他のモル質量モーメントも示されています。これらは通常、異種ポリマーに関連しますが、不連続サイズのタンパク質には関連しません。ソフトウェアによって生成される他の多くの結果は、質量回復率(注入量に対して濃度検出器を介してELEL化したタンパク質の割合)、ピーク統計、多分散性、Rgなどのレポートに含まれる可能性があります。とRhモーメントなど提供される場合、不確実性の尺定は、測定シリーズ内のノイズに基づいて引用された値の精度を反映し、精度を表すとは考えるべきではありません。報告された値の真の精度は、提供されるdn/dcの精度や消滅係数値、計器のキャリブレーションなど、さまざまな要因によって異なります。 [ファイル]メニューから、[方法として保存]を選択し、分析した BSA データを、すべてのタイプのタンパク質の将来の測定の標準的な方法として保存します。BSA に対して決定された正規化およびバンド拡大パラメータは、解析で引き継がされます。