Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Daniel Some; Hadar Amartely; Ayala Tsadok; Mario Lebendiker

doi:10.3791/59615

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Biochemistry

Caratterizzazione delle proteine mediante cromatografia di dimensioni-esclusione accoppiata alla dispersione luminosa multi-angolo (SEC-MALS)

Published: June 20, 2019

doi:

10.3791/59615

Daniel Some¹, Hadar Amartely², Ayala Tsadok³, Mario Lebendiker²

¹Wyatt Technology Corporation, ²Wolfson Centre for Applied Structural Biology, The Alexander Silberman Institute of Life Science,The Hebrew University of Jerusalem, ³Danyel Biotech Ltd.

Summary

Questo protocollo descrive la combinazione della cromatografia ad esclusione di dimensioni con la dispersione della luce multi-angolo (SEC-MALS) per la caratterizzazione assoluta di proteine e complessi nella soluzione. SEC-MALS determina il peso molecolare e le dimensioni di proteine pure, oligomeri nativi, eterocomplessi e proteine modificate come le glicoproteine.

Abstract

La cromatografia analitica di esclusione delle dimensioni (SEC), comunemente utilizzata per la determinazione del peso molecolare delle proteine e dei complessi proteina-proteina in soluzione, è una tecnica relativa che si basa sul volume di eluizione dell’analita per stimare le molecole molecolari peso. Quando la proteina non è globulare o subisce interazioni di colonna non ideali, la curva di calibrazione basata sugli standard proteici non è valida e il peso molecolare determinato dal volume di eluizione non è corretto. La dispersione della luce multi-angolo (MALS) è una tecnica assoluta che determina il peso molecolare di un analita in soluzione dalle equazioni fisiche di base. La combinazione di SEC per la separazione con MALS per l’analisi costituisce un mezzo versatile e affidabile per caratterizzare le soluzioni di una o più specie proteiche, tra cui monomeri, oligomeri nativi o aggregati ed eterocomplessi. Poiché la misurazione viene eseguita ad ogni volume di eluizione, SEC-MALS può determinare se un picco di elusione è omogeneo o eterogeneo e distinguere tra una distribuzione del peso molecolare fisso e un equilibrio dinamico. È anche possibile un’analisi di proteine modificate come glicoproteine o lipoproteine, o coniugati come proteine di membrana solubilita-detersivo. Quindi, SEC-MALS è uno strumento critico per il chimico proteico che deve confermare le proprietà biofisiche e il comportamento della soluzione delle molecole prodotte per la ricerca biologica o biotecnologica. Questo protocollo per SEC-MALS analizza il peso molecolare e le dimensioni dei monottri e aggregati di proteine pure. I dati acquisiti servono come base per ulteriori analisi SEC-MALS, tra cui quelle di complessi, glicoproteine e proteine a membrana legate ai surfactant.

Introduction

L’analisi affidabile del peso molecolare (MW) delle proteine in soluzione è essenziale per la ricerca biomolecolare¹^,²^,³^,⁴. L’analisi MW informa lo scienziato se è stata prodotta la proteina corretta e se è adatta per l’uso in ulteriori sperimentazioni⁵^,⁶. Come descritto sui siti web delle reti di ricerca sulle proteine P4EU⁷ e ARBRE-Mobieu⁸, il controllo della qualità delle proteine deve caratterizzare non solo la purezza del prodotto finale, ma anche il suo stato oligomerico, l’omogeneità, l’identità, la conformazione, modifiche post-traduzione e altre proprietà.

La misurazione MW in soluzione non denaturante identifica la forma della proteina presente in un ambiente acquoso, sia monomerico che oligomerico. Mentre per molte proteine l’obiettivo è quello di produrre la forma monomerica, per altri uno specifico oligomero nativo è la chiave per l’attività biologica⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹². Altri oligomeri e aggregati non nativi sono indesiderabili e porteranno a difetti nella determinazione strutturale per cristallografia, risonanza magnetica nucleare (NMR) o dispersione a raggi X a piccolo angolo, così come artefatti o imprecisioni nei test funzionali per quantifica il legame per calorimetria di titola isotermica o risonanza di plasmoni superficiale²^,¹³.

Nel caso di bioterapie come gli anticorpi monoclonali (mAb), l’analisi MW basata su soluzioni ha lo scopo simile di controllo della qualità e caratterizzazione del prodotto. Aggregati e frammenti eccessivi sono indicativi di un prodotto instabile che non è adatto all’uso umano. Le agenzie di regolamentazione richiedono un’attenta caratterizzazione, non solo della molecola terapeutica, ma anche dei potenziali degradanti che possono essere presenti nel prodotto finale¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷.

Alcuni dei metodi più diffusi per l’analisi delle proteine MW sono l’elettroforesi da gel di polimembranule solfato di sodio (SDS-PAGE), l’elettroforesi capillare (CE), la PAGE nativa, la spettrometria di massa (MS), la cromatografia ad esclusione di dimensioni (SEC) e l’analisi l’ultracentrifugazione (AUC). Di questi, SDS-PAGE, CE e MS non vengono eseguiti nello stato nativo e in genere portano alla dissociazione di oligomeri e aggregati, quindi non sono adatti per determinare l’oligomero nativo o quantificare gli aggregati. Anche se PAGE nativo fa, teoricamente, mantenere lo stato nativo, nella nostra esperienza è difficile da ottimizzare per molte proteine, e risultati non sono molto affidabili. L’AUC, sia per velocità di sedimentazione che per equilibrio di sedimentazione, è quantitativo e può determinare l’MW dai primi principi, ma è abbastanza ingombrante, richiede molto lavoro manuale e una significativa esperienza nell’interpretazione dei dati, tempi di sperimentazione lunghi e un strumento molto costoso.

LA SEC analitica è un metodo semplice e quantitativo e relativamente robusto che separa le macromolecole durante il flusso attraverso una colonna compressa. I principi e le applicazioni della SEC sono ben presentati in diverse recensioni¹⁸^,¹⁹^,²⁰ e nel manuale “Size Exclusion Croromatography: Principles and Methods”²¹. Le differenze di ritenzione sono dovute a diverse quantità di tempo trascorso a diffondersi dentro e fuori i pori nella fase stazionaria prima di eluire dalla fine della colonna. Le differenze sorgono (nominalmente) dalle dimensioni relative e dai coefficienti di diffusione delle molecole²². Una curva di calibrazione viene costruita utilizzando una serie di molecole di riferimento, che collegano l’MW della molecola al volume di eluizione. Per le proteine, le molecole di riferimento sono generalmente proteine globulari ben aloroche che non interagiscono con la colonna tramite carica o residui di superficie idrofobici. Il volume di eluizione viene misurato con un rilevatore di assorbimento ultravioletto (UV). Se il coefficiente di estinzione UV è noto- spesso calcolato dalla sequenza-la massa totale di picco della proteina può anche essere quantificata.

In particolare, l’analisi di MW da parte della SEC si basa su due presupposti chiave per quanto riguarda le proteine da caratterizzare: 1) condividono con gli standard di riferimento la stessa conformazione e volume specifico (in altre parole, la stessa relazione di diffusione tra proprietà e MW) e 2) come gli standard di riferimento, non interagiscono con la colonna se non per proprietà steriche – non aderiscono all’imballaggio della colonna a pagamento o interazioni idrofobiche. Le deviazioni da questi presupposti invalidano la curva di calibrazione e portano a determinazioni MW errate. Questo è il caso delle proteine intrinsecamente disordinate che hanno grandi raggi Stokes a causa delle loro vaste regioni non strutturate²³^,²⁴ o gruppi oligomerici non sferici/lineari¹⁰. Le proteine glicosillate avranno generalmente un raggio di Stokes più grande rispetto alla forma non glicosata, anche quando la massa di carboidrati aggiunta viene presa in considerazione¹⁹. Le proteine della membrana detergenti esolutie in modo diverso rispetto alle proteine di calibrazione perché la loro elusione dalla SEC dipende dalla dimensione totale del complesso polypeptide-detergent-lipidi piuttosto che dallo stato oligomerico e dalla massa molare della proteina²⁵ ^,²⁶. Chimica di colonna, pH e condizioni di sale influenzano tutti i volumi di eluizione di proteine con residui di superficie caricati o idrofobici²⁷^,²⁸.

SEC diventa molto più versatile e affidabile per la determinazione MW quando combinato con la dispersione della luce multi-angolo (MALS) e l’indice di rifrazione differenziale (dRI) rilevatori³^,⁴^,¹¹^,²⁹^, ³⁰^,³¹^,³². Un rilevatore dRI determina la concentrazione in base alla modifica dell’indice di rifrazione della soluzione a causa della presenza dell’analita. Un rivelatore MALS misura la proporzione di luce dispersa da un analita in più angolazioni rispetto al raggio laser incidente. Collettivamente nota come SEC-MALS, questa strumentazione determina MW indipendentemente dal tempo di eluizione poiché MW può essere calcolato direttamente dai primi principi utilizzando l’equazione 1,

①

dove M è il peso molecolare dell’analita, R(0) il rapporto Raggio ridotto (cioè la quantità di luce dispersa dall’analita rispetto all’intensità del laser) determinata dal rilevatore MALS ed estrapolata nell’angolo zero, concentrazione di peso determinata dal rilevatore UV o dRI, dn/dc l’incremento dell’indice di rifrazione dell’analita (essenzialmente la differenza tra l’indice di rifrazione dell’analita e il buffer), e K una costante ottica che dipende dal proprietà di sistema come la lunghezza d’onda e l’indice di rifrazione del solvente²⁹.

In SEC-MALS, la colonna SEC viene utilizzata esclusivamente per separare le varie specie in soluzione in modo che entrino singolarmente nelle cellule MALS e nel rivelatore di concentrazione. Il tempo di ritenzione effettivo non ha alcun significato per l’analisi, se non per quanto bene risolve la specie proteica. Gli strumenti sono calibrati indipendentemente dalla colonna e non si basano su standard di riferimento. Di conseguenza, SEC-MALS è considerato un metodo “assoluto” per la determinazione MW dalle equazioni fisiche di base. Se il campione è eterogeneo e non completamente separato dalla colonna, il valore fornito ad ogni volume di eluizione sarà una media di peso delle molecole in ogni volume di eluizione che scorre attraverso la cella di flusso per fetta temporale, circa 75L.

Analizzando la variazione angolare dell’intensità di dispersione, MALS può anche determinare la dimensione (raggio radice-medio-quadrato, R_g) di macromolecole e nanoparticelle con raggio geometrico maggiore di circa 12,5 nm²⁹. Per le specie più piccole come le proteine monomeriche e gli oligomeri, un modulo DLS (Dynamic Light Scattering) può essere aggiunto allo strumento MALS per misurare i raggi idrodinamici da 0,5 nm e fino a³³.

Mentre l’analisi della concentrazione UV o dRI può fornire il valore di c in Eq. 1, l’uso di dRI è preferito per due motivi: 1) dRI è un rilevatore di concentrazione universale, adatto per l’analisi di molecole come zuccheri o polisaccharides che non contengono un UV cromofoso³⁴; e 2) la risposta alla concentrazione dn/dc di quasi tutte le proteine pure nel buffer acquoso è la stessa entro uno o due per cento (0,185 mL/g)³⁵, quindi non c’è bisogno di conoscere il coefficiente di estinzione UV.

L’uso di SEC-MALS nella ricerca sulle proteine è piuttosto esteso. Di gran lunga le applicazioni più comuni sono stabilire se una proteina purificata è monomerica o oligomerica e il grado di oligomerizzazione, e la valutazione di aggregati³^,¹⁰^,¹¹^,¹⁷^, ³¹^,³⁶^,³⁷^,³⁸. La capacità di farlo per le proteine di membrana solubilita detersivo che non possono essere caratterizzate da mezzi tradizionali è particolarmente apprezzata, e sono stati pubblicati protocolli dettagliati per questo sono stati pubblicati³¹^,³⁹^,⁴⁰ ^, ⁴¹ del sistema ^, ⁴² o più ^, ⁴³. Altre applicazioni comuni includono la definizione del grado di modifica post-traduzionale e la polidispersità della glicoproteina, della lipoproteina e di coniugati simili⁴^,³¹^,⁴⁴ ^, ^{45 anni} ^, ⁴⁶ per quanto ^, ⁴⁷; la formazione (o la loro mancanza) e la stoichiometria assoluta (a differenza del rapporto stoicometrico) di eterocomplessi tra cui proteine-proteine, nuclei proteici-nuclei acidi e complessi proteina-polisacaridi²⁴^,⁴⁶^, ⁴⁸^,⁴⁹^,⁵⁰^,⁵¹^,⁵²; determinazione della costante di dissociazione dell’equilibrio monomer-dimer⁴⁹^,⁵³^,⁵⁴; e valutando la conformazione proteica⁵⁵^,⁵⁶. Al di là delle proteine, SEC-MALS è inestimabile per la caratterizzazione dei peptidi⁵⁷^,⁵⁸, polimeri naturali ampiamente eterogenei come heparins⁵⁹ e chitosani⁶⁰^,⁶¹, piccoli virus⁶² e la maggior parte dei tipi di polimeri sintetici o trasformati⁶³^,⁶⁴^,⁶⁵^,⁶⁶. Una vasta bibliografia può essere trovata nella letteratura⁶⁷ e online (al http://www.wyatt.com/bibliography).

Qui presentiamo un protocollo standard per l’esecuzione e l’analisi di un esperimento SEC-MALS. L’albumina del siero bovino (BSA) è presentato come un esempio per la separazione e la caratterizzazione di monomeri proteici e oligomeri. Il protocollo BSA determina alcune costanti di sistema che fungono da base per ulteriori analisi SEC-MALS, comprese quelle di complessi, glicoproteine e proteine di membrana legate ai surfactanti.

Notiamo che SEC-MALS può essere eseguita utilizzando apparecchiature standard di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) o di cromatografia liquida a proteina veloce (FPLC) di molti fornitori. Questo protocollo descrive l’uso di un sistema FPLC comunemente presente nei laboratori che producono proteine per la ricerca e lo sviluppo (cfr. tabella dei materiali). Prima di eseguire il protocollo, il sistema FPLC, i rilevatori MALS e dRI avrebbero dovuto essere installati, insieme ai rispettivi pacchetti software per il controllo, l’acquisizione e l’analisi dei dati secondo le istruzioni dei produttori e le costanti di calibrazione necessarie o altre impostazioni inserite nel software. Un filtro in linea deve essere posizionato tra la pompa e l’iniettore con una membrana idrofila, 0,1 m o pore installato.

Protocol

1. Preparazione del sistema Collegare i rilevatori MALS e dRI a valle del rilevatore UV dell’FPLC. Ignorare i rilevatori di pH e conduttività poiché aggiungeranno un significativo volume interdetector tra i rivelatori UV e MALS. Utilizzare tubi capillari di 0,25 mm i.d. dalla colonna a e tra i rivelatori e 0,75 mm i.d. tubi capillari sull’uscita dei rivelatori ai rifiuti o al collettore di frazioni. Assicurarsi che siano state stabilite le connessioni di segnale necessarie tra l’FPLC e i rilevatori, tra cui l’uscita analogica dal rivelatore UV all’ingresso analogico MALS e l’uscita digitale dall’FPLC all’autoinietto MALS Autoinject, tramite la casella I/O di FPLC. Installare una colonna SEC analitica adatta che copra un intervallo di frazionamento di almeno 20 kDa a 500 kDa. Controllare le informazioni sul prodotto per determinare se la colonna è adatta per la gamma di MW, pH e altre proprietà del campione e della fase mobile. 2. Preparazione del buffer, f lussureggiantiing il sistema durante la notte e il controllo della pulizia Utilizzando reagenti di qualità HPLC, preparare 1 L di salina con buffer fosfato con 50 – 100 mM NaCl. Filtrare il buffer a 0,1 m utilizzando un filtro di poliether sulfone in poliether superiore a bottiglia o simili. Filtrare i primi 50-100 mL di tampone in una bottiglia di scarto e scartare, al fine di eliminare il particolato dai filtri a secco, quindi filtrare il resto in una bottiglia pulita e sterile che è stata lavata accuratamente con acqua filtrata e ionizzata e limitata per evitare polvere di entrare.NOTA: Altri solventi di fase mobile come un buffer Tris possono essere utilizzati se devono essere analizzate proteine aggiuntive che sono preferibilmente disciolte in tali solventi. Scalare durante la notte ad una portata di 0,5 mL/min, o come altrimenti raccomandato dal produttore della colonna, per eclicare la colonna nel buffer e rimuovere il particolato. Utilizzare la modalità Flusso continuo di FPLC e assicurarsi che il flusso non si interrompa fino al completamento di tutte le esecuzioni DI SEC-MALS. Posizionare la cella di flusso dRI in modalità Dispurazione durante lo svuotamento notturno. Disattivare l’eliminazione prima di iniziare l’esecuzione dell’esempio. All’inizio dello sciacquone, aumentare gradualmente la portata per evitare l’effetto di “spargimento di colonne” (o rilascio di particelle) causato da un improvviso cambiamento di pressione nella colonna. Se il sistema è noto per essere abbastanza stabile e privo di particelle, e in equilibrio con la fase mobile desiderata, sostituire il colore notturno con un colore più corto, 2-3 h. Controllare la pulizia del sistema toccando leggermente il tubo a valle della colonna per rilasciare le particelle accumulate e osservando il segnale nel rilevatore a 90 gradi sul display del pannello anteriore dello strumento MALS. Verificare che il rumore di picco-picco non sia superiore a 50 -100 V. Eseguire un’iniezione “vuota” per verificare che l’iniettore sia pulito dalle particelle. Un “vuoto” è semplicemente il buffer in esecuzione, preparato in una fiala fresca e sterile. Se il picco delle particelle non è superiore a 1 mL di volume e non superiore a 5 mV sopra la linea di base, il sistema è pronto per i campioni. In caso contrario, eseguire ulteriori iniezioni vuote fino a pulire, o eseguire la manutenzione per pulire l’iniettore. 3. Preparazione e caricamento del campione Preparare almeno 200 L di BSA a 1-2 mg/mL nel buffer SEC.NOTA: Al fine di prevenire le precipitazioni, BSA non deve mai essere disciolto in acqua pura. Filtrare la proteina a 0,02 m utilizzando un filtro a siringa. Scartare le prime gocce di filtrata per eliminare le particelle dai filtri secchi. In alternativa, centrificare il campione a 10.000 x g per 15 min per consentire la precipitazione di aggregati non solubili e altre particelle di grandi dimensioni. Inserire nel ciclo 100 l della soluzione BSA.NOTA: Questa è la quantità raccomandata di materiale e più o meno può essere iniettata in base alle circostanze del campione come stabilità o disponibilità. La quantità di proteine necessaria per iniezione varia inversamente con il peso molecolare – è necessaria il doppio della massa proteica se il peso molecolare è di 33 kDa, o la metà di quello della BSA. 4. Preparazione del software MALS Apri Nuovo Sperimentare da Metodo nel menu del software MALS e selezionare il metodo online dalla cartella Metodi di sistema Light Scattering. Se è presente un rilevatore DLS, selezionare il metodo Online dal menu Con la cartella QELS. Nella sezione Configurazione impostare i parametri della fase di esempio e mobile. Nella vista Pompa generica, impostare la portata su quella utilizzata in FPLC. Nella visualizzazione Pompa generica, ramo Solvente, campo Nome, selezionare PBS. Nella vista Iniettore, Diramazione di esempio, immettere il Nome come BSAe impostare dn/dc – 0,185 (il valore standard per le proteine non modificate), a2 e coefficiente di estinzione UV – 0,667 mL/(mg-cm).NOTA: Per altre proteine, il coefficiente di estinzione UV280 nm può essere trovato nella letteratura o calcolato dalla sua sequenza utilizzando vari strumenti software di pubblico dominio. Nella sezione Procedure, visualizzazione Raccolta di base, selezionare la casella di controllo Attiva all’iniezione automatica e impostare la durata della corsa su 70 min in modo che i dati vengano raccolti per l’intera elusione fino al volume totale di permeazione della SEC viene raggiunta la colonna.NOTA: la quantità di tempo necessaria può variare in base alla colonna e alla portata: sono necessari 35 min di raccolta per una colonna standard di 7,8 mm x 300 mm HPLC-SEC a 0,5 mL/min. Avviare l’esperimento nel software MALS facendo clic sul pulsante Esegui. Inizierà a leggere i dati dopo aver ricevuto il segnale di impulso dallo strumento FPLC tramite il rilevatore MALS. Azzerare il segnale dRI facendo clic sul pulsante Autozero sul pannello anteriore dello strumento. 5. Preparazione del software FPLC Inserire il nome della proteina e la corsa nel software FPLC, in Manual Eseguire istruzioni manuali Imposta contrassegno. Cambiare la valvola di iniezione da Carico manuale a Inietta in Percorso di flusso Valvola di iniezione. Includere un segnale di impulso inserendo un impulso di 0,5 s sotto la casella I/O . Pulse digitale fuori. Questo attiverà la raccolta dei dati nel software MALS. 6. Iniettare il campione nel ciclo. Fare clic su Esegui nel software FPLC per avviare l’esecuzione dell’esperimento. 7.Analisi dei dati SEC-MALS BSA Eseguire l’analisi, passo dopo passo, nella sezione Procedure del software MALS. Verificare che i picchi vengano visualizzati, approssimativamente con lo stesso volume di eluizione in UV, MALS e RI, controllando la vista Raccolta di base. Nella vista Linea di base, definire la linea di base per tutti i segnali (tutti i rilevatori LS, UV e dRI). Le linee di base devono essere definite per indicare il livello di solvente puro, preferibilmente allungandoda da un lato del campione picchi all’altro. Nella vista Picchi, definite i picchi da analizzare facendo clic e trascinando il mouse. Selezionare il 50% centrale di ogni picco. Selezionare prima il picco del monomere (‘Peak 1’) e poi il picco di dimero (‘Peak 2’). Verificare i valori corretti di dn/dc – coefficiente di estinzione UV 280 nm – 0,667 per BSA sotto ogni picco. Eseguire l’allineamento dei picchi, la correzione dell’ampliamento delle bande e le procedure di normalizzazione.NOTA: Normalmente il metodo SEC-MALS viene periodicamente calibrato per l’allineamento del picco, l’ampliamento della banda e la normalizzazione dei rilevatori angolari al rilevatore a 90 gradi utilizzando una proteina monodispersione con raggio di rotazione Rg < 10 nm come BSA monomero. In questo esempio, BSA funge sia da molecola di calibrazione ed è essa stessa oggetto dell'analisi MW. Nella sezione Procedure Vista tracciato, selezionare l’area centrale dei picchi facendo clic e trascinando il mouse, fare clic su Allinea segnali e quindi su OK. Nella sezione Procedure Vista ad un ampliamento della banda, scegliere il 50% centrale del picco del monomero. Assicurarsi che il rilevatore RI sia specificato come strumento di riferimento, quindi fare clic su Esegui adattamento e applica per abbinare i segnali UV e LS al segnale RI. Ingrandire i picchi per verificare che si sovrappongano molto strettamente all’interno del 50-70% centrale, quindi fare clic su OK. Se la sovrapposizione non è perfetta, (potrebbe essere necessario) eseguire la misura e “Applicare” una o due volte più fino a quando la sovrapposizione è eccellente. Nella sezione Procedure Visualizzazione di normalizzazione, selezionare Picco 1, immettere 3,0 nm come valore R g, fare clic su Normalizza, quindi su OK. Nella sezione Procedure Massa molare e Rg dalla vista MALS, esaminare i dati per determinare quali, se presenti, angoli di rilevamento devono essere deselezionati dall’analisi a causa di un rumore eccessivo. In genere, questi saranno gli angoli inferiori in cui le particelle di polvere disperdono un’intensità relativamente alta. Selezionare singole sezioni all’interno dei picchi dal grafico a destra e visualizzare la dipendenza angolare del rapporto Rayleigh ridotto inverso nel grafico a sinistra. Se gli angoli più bassi (e talvolta i più alti) si discostano costantemente dalla forma, deselezionali dall’elenco nella parte inferiore della vista. Visualizzare il grafico dei risultati nella visualizzazione Grafico EASI. Selezionare Massa Molare dal menu a discesa Schermo nella parte superiore della finestra. Utilizzare CTRL e fare clic e trascinare per ingrandire la regione di picco. Visualizza i risultati finali della massa molare media di peso tabulato per i picchi di monotmeri e dimer nei risultati Report (riepilogo) nella sezione Risultati di picco Momenti di massa molare (g/mol) Mw. La purezza è riportata in Risultati di picco Frazione di massa(%).NOTA: vengono mostrati anche altri momenti di massa molare; questi sono di solito rilevanti per i polimeri eterogenei, ma non per le proteine con dimensioni discrete. Molti altri risultati prodotti dal software possono essere inclusi nel rapporto come percentuale di recupero di massa (la frazione di proteina elata tramite il rilevatore di concentrazione rispetto alla quantità iniettata), statistiche di picco, polidispersità, Rg e Rh momenti, ecc. Se fornite, le misure di incertezza riflettono la precisione del valore citato in base al rumore all’interno della serie di misurazione e non devono essere considerate come una rappresentazione dell’accuratezza. La vera precisione dei valori riportati dipende da vari fattori, come l’accuratezza dei valori di coefficiente di dn/dc forniti e di estinzione, la calibrazione dello strumento, ecc. Dal menu File, selezionare Salva come metodo e salvare i dati BSA analizzati come metodo standard per misurazioni future di tutti i tipi di proteine. I parametri di normalizzazione e di ampliamento delle bande determinati per BSA saranno trasferiti nell’analisi.

Representative Results

La figura 1a,b mostra che tre forme oligomeriche di BSA: momero, dimero e trimer, erano ben separate sulla colonna dei pori da 200 euro con risoluzione di base di monomero e dimero, mentre la figura 2a mostra che la separazione su una colonna di 75 pori non raggiungere una buona risoluzione monomer-dimero. Quest’ultimo esempio è stato incluso per illustrare un risultato “povero”; queste differenze di separazione per le due colonne possono, infatti, essere previste in base alle gamme di separazione indicate dal produttore. Il trimer non è completamente separato dal dimero e gli oligomeri superiori non sono ben separati dal trimer e l’uno dall’altro. La figura 2b è un esempio di segnale di dispersione della luce rumoroso con particelle presenti in tutto il cromatogramma, che impedisce una determinazione accurata di MW. D’ora in poi ci concentriamo sulla figura 1b. Il monomero, che si è comportato a 13,8 mL, presenta una massa molare media del peso Mw di 64,1 x 0,4 kDa determinata da MALS e raggio idrodinamico Rh di 3,54 x 0,01 nm. Questi risultati sono in accordo con la massa di sequenza e il raggio idrodinamico noto di BSA, 66.4 kDa e 3.5 nm rispettivamente68, alla precisione consueta di SEC-MALS, 5%3,69. Il dimero, che ha oscillato a 12 mL, ha mostrato un valore Mw di 127 x 1 kDa determinato da MALS-as expected, il doppio di quello del monomero all’interno di precisione sperimentale e Rh di 5.68 – 0.06 nm. Il picco del trimer è stato osservato anche a 11 mL con Mw di 194 x 9 kDa determinato da MALS, tre volte quello del monomero entro la precisione sperimentale, come previsto. R h del trimer non è stato possibile determinare a causa della bassa intensità del segnale DLS. I punti di massa molare calcolati attraverso il picco del monomero sono uniformi entro il 2-5%, indicando omogeneità. Non è insolito trovare una spalla finale con massa molare nella gamma di 38-50 kDa, corrispondente a frammenti di BSA70. I punti di massa molare attraverso i picchi cupi e trimerici non sono uniformi, indicativi di eterogeneità. Il picco di dimero è in qualche modo eterogeneo a causa di tracce di trimer che sanguinano nel picco di dimero, e il picco trimer è eterogeneo a causa della co-elutionizione di oligomeri superiori mal risolti. Il livello di segnale-rumore del picco del monomero è abbastanza accettabile in tutti e tre i segnali, oltre 100:1, così come il picco di dimero con segnale-rumore di 40:1. Le regioni del cromatogramma oltre i picchi proteici sono piatte, con l’eccezione di un picco dovuto al particolato vicino al volume di esclusione totale (vuoto) nella traccia LS e un picco di sale (positivo) e un picco di aria disciolto (negativo) nella traccia dRI, vicino alla permeazione totale volume. Questi sono indicati in Figura 1a. Il livello di purezza può anche essere calcolato in un esperimento SEC-MALS: la frazione di massa del picco monomerico nel rapporto rappresenta la percentuale di purezza della forma monomerica. Per il monomero BSA, la purezza calcolata è dell’88%. Figura 1 : analisi SEC-MALS dell’albumina del siero bovino (BSA) utilizzando una colonna di esclusione delle dimensioni dei pori di 200 gradi. Le tracce del cromatogramma sono normalizzate al picco del monomero e all’offset per chiarezza chiarezza. (A) Vengono indicati gli artefatti comuni che possono essere ignorati, tra cui un picco di particelle vicino all’inizio del segnale di dispersione della luce, nonché picchi di sale e aria dissolta vicino al volume totale di permeazione nel segnale dell’indice di rifrazione. (B) Il cromatogramma presenta un’eccellente separazione monomer-dimer-trimer e il segnale di dispersione della luce presenta un alto segnale-rumore. I valori di MW monomer e dimero presentano un’elevata omogeneità. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2 : Esempi di analisi SEC-MALS di bassa qualità. Le tracce del cromatogramma sono normalizzate al picco del monomero e all’offset per chiarezza chiarezza. (A) Separazione inadeguata su una colonna di esclusione delle dimensioni dei pori di 75; un picco di particelle tra 8 e 9 min non è ben separato dalle proteine. (B) Un rapporto segnale-rumore inadeguato e le particelle estese adiacenti alle proteine sono evidenti nel segnale di dispersione della luce (LS). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

L’esperimento SEC-MALS ha fornito una buona separazione di momero, dimero e trimer e risultati quantitativi per le masse molare e le dimensioni idrodinamiche di ogni picco. Questo a sua volta identifica chiaramente e caratterizza ogni specie presente, oltre a quantificare la purezza. Di solito i risultati ottenuti sono accurati entro il 5%, e precisi e ripetibili entro 1-2%³^,⁶⁹. Questo livello di precisione e ripetibilità consente di distinguere con sicurezza tra specie che possono essere vicine in MW, purché siano separate da SEC (possono parzialmente sovrapporsi all’interno dello stesso picco). I benefici per il controllo della qualità delle proteine e la caratterizzazione biofisica fondamentale sono evidenti.

La verifica dell’assenza di particolato è molto importante per le misurazioni SEC-MALS sensibili e ripetibili. I picchi di particelle appaiono generalmente come grandi segnali MALS non accompagnati da segnali UV o RI comparabili. La fase mobile e il campione devono essere preparati con attenzione per eliminare tali particelle. L’uso di reagenti di qualità HPLC o, meglio, la filtrazione della fase mobile e del buffer di diluizione a 0,1 – 0,2 m (pre-lavaggio del filtro per eliminare le particelle sempre presenti sulle membrane secche), la manutenzione di bottiglie di fase mobili extra-pulite e di altri Si raccomandano SEC-MALS e l’equilibratura della colonna estesa in flusso (per rimuovere le particelle e gli aggregati che possono essersi accumulati quando il flusso è stato interrotto o una colonna non in uso). Il campione deve essere filtrato in base alla dimensione minima dei pori che non rimuova il materiale di interesse, di solito non più grande di 0,1 m e, se possibile, 0,02 m. Se il filtro si intasa rapidamente, il campione può essere centrifuso, filtrato in fasi di dimensione dei pori decrescenti e/o nuovamente purificato. Quando i sistemi sono mantenuti in modo coerente con una fase mobile di alta qualità, fresca e filtrata, gli ammortizzatori delle colonne sono prevenuti, i campioni sono puliti e non aderiscono alla colonna, le misurazioni non mostreranno il rumore del particolato di cui sopra e dati di alta qualità.

MALS è agnostico ai tipici buffer SEC per le proteine; molti altri sistemi di buffer oltre a PBS possono essere utilizzati per ottimizzare la separazione e la stabilità, tra cui una varietà di eccipienti⁷¹. MALS è anche agnostico alla colonna specifica, che dovrebbe essere selezionata per una separazione e un recupero ottimali. Le preoccupazioni principali per gli eccipiti in merito all’analisi sono modifiche significative nell’indice di rifrazione, che portano alla modifica dello specifico incremento dell’indice di rifrazione dn/dce degli eccipienti che assorbono 280 nm quando è necessaria l’analisi UV. Ad esempio, l’arginina è un’excipiente che riduce l’aggregazione comune che può influenzare notevolmente il dn/dc di una proteina tipica, anche portandola nel regime negativo (una proteina con dn/dc negativo può ancora essere analizzata da SEC-MALS se dn/ dc è determinato empiricamente, ma se dn/dc s 0 l’intensità della luce dispersa dalla proteina sarà nulla e l’analisi MW sarà impossibile). L’argomento dei valori di dn/dc per le proteine è ampiamente illustrato da^35, in cui è stato illustrato che per i buffer acquosi standard, la stragrande maggioranza delle proteine non modificate rientra nel 2-3% del valore standard (0,185 o 0,186 mL/g a 660 nm) , anche se le proteine al di sotto di 10 kDa sono più variabili, e ci sono alcune specie che possono arrivare fino a 0,21 mL/g.

I profili MW in tutto il monomero BSA e picchi didimero nei dati presentati erano entrambi abbastanza omogenei entro il 2% o meno, indicando specie monodisperse. I valori MW non uniformi su un picco possono derivare da un’eterogeneità o da un’analisi impropria. In particolare, un profilo BSA MW concavo (‘sorriso’) o convessa (‘grimace’) potrebbe derivare dalla non applicare correttamente la correzione di ampliamento della banda. Per altre proteine, un profilo convesso potrebbe anche derivare da un equilibrio dinamico tra monomeri e oligomeri, dove il rapporto tra momomero e oligomero- e quindi l’apparente valore MW-dipende dalla concentrazione di picco (BSA non mostra questo comportamento ed è spesso utilizzato come campione di controllo per verificare i parametri corretti di ampliamento della banda). Un profilo MW che varia dal bordo finale e non cambia con la concentrazione del campione è tipico di una distribuzione di specie di peso molecolare parzialmente risolte dalla SEC. fonti di distribuzioni apparentemente inomogenee iniettando diverse quantità totali di proteine- la distribuzione varierà con l’equilibrio dinamico, ma non con una distribuzione fissa o una correzione errata di ampliamento della banda.

Dati i vincoli descritti in precedenza, SEC-MALS non è adatto per varie attività. Non è adatto per l’analisi di campioni grezzi; i campioni devono essere ben purificati da standard affinità e metodi di lucidatura. Non ha sufficiente precisione o potere di risoluzione per identificare mutanti e varianti di una proteina o mAb con massa stessa o molto stretta, e non può essere utilizzato con analiti che non si elusio da o separato su una colonna SEC, anche se recentemente è stato dimostrato che ion-exchang La cromatografia a fase inversa può essere combinata con MALS per separare e caratterizzare le specie che non vengono risolte da SEC⁷²^,⁷³^,⁷⁴. Quando le quantità di proteine sono fortemente vincolate, SEC-MALS potrebbe non essere fattibile in quanto richiede in genere da 10 a 200 g³ e anche più potrebbe essere richiesto da un sistema FPLC con diametro interno del tubo maggiore di 0,25 mm; tuttavia, quantità minori possono essere analizzate da UHPLC-SEC-MALS. Le proteine altamente instabili che si aggregano al momento dell’introduzione nella fase mobile non sono adatte per l’analisi SEC-MALS, anche se l’ottimizzazione del buffer utilizzando la dispersione dinamica della luce off-line può superare questo problema⁷⁵.

Nonostante lo sforzo aggiuntivo che la SEC-MALS comporta, è inestimabile per la ricerca sulle proteine ed è ampiamente utilizzato dalle comunità accademiche e biofarmaceutiche. Oltre alla caratterizzazione di monomeri, oligomeri e aggregati come descritto nel protocollo precedente, SEC-MALS può caratterizzare le proteine modificate come le le cicoproteine (determinando il MW della proteina e dei componenti glicani singolarmente), proteine della membrana lipidi-soluttiviche (determinazione dell’MW dei componenti proteina e solubilizer individualmente), gruppi proteici come particelle proteiche, complessi acidi proteici-proteici e nuclei proteici, polisafini, proteina-polisaccaride, peptidi e molte altre biomacromolecole.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo il Dr. Tsafi Danieli (Wolfson Centre for Applied Structural Biology, Università Ebraica) per consigli e collaborazioni. Ringraziamo anche Daniel Biotech Ltd. (Rehovot, Israele) per l’assistenza e l’istituzione del sistema analitico FPLC-MALS utilizzato in questo studio.

Materials

AKTA pure	GE Healthcare	29-0182-26	fast protein liquid chromatograph (FPLC)
AKTA UNICORN	GE Healthcare		FPLC control software
ASTRA	Wyatt Technology		MALS data acquisition and analysis software
Bovine serum albumine (purity >97%)	Sigma	A1900	analyte
DAWN or miniDAWN	Wyatt Technology	WH2 or WTREOS	multi-angle light scattering (MALS) detector
Increase 200 10/300	GE Healthcare		size exclusion column, 200 Å pores, 10 mm i.d., 300 mm length
Optilab	Wyatt Technology	WTREX	differential refractive index (RI) detector
Sodium chloride NaCl	Sigma	71382	HPLC grade NaCl
Stericup bottle top filter polyether sulfone 0.1 µm 1000 mL	Millipore	SCVPU11RE	mobile phase filter
Whatman Anotop 10 syringe filter 0.02 µm	GE Healthcare	6809-1002	sample filter
Whatman Anotop 10 syringe-tip filter, 0.1 µm pore, 10 mm diameter	GE Healthcare	6809-1012	sample filter
Whatman Anotop 25 syringe filter 0.1 µm	GE Healthcare	6809-2012	mobile phase filter
WyattQELS	Wyatt Technology	WIQ	dynamic light scattering detector

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Some, D., Amartely, H., Tsadok, A., Lebendiker, M. Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS). J. Vis. Exp. (148), e59615, doi:10.3791/59615 (2019).

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