Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Daniel Some; Hadar Amartely; Ayala Tsadok; Mario Lebendiker

doi:10.3791/59615

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Biochemistry

Charakterisierung von Proteinen durch Größen-Ausschluss-Chromatographie gekoppelt an Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Published: June 20, 2019

doi:

10.3791/59615

Daniel Some¹, Hadar Amartely², Ayala Tsadok³, Mario Lebendiker²

¹Wyatt Technology Corporation, ²Wolfson Centre for Applied Structural Biology, The Alexander Silberman Institute of Life Science,The Hebrew University of Jerusalem, ³Danyel Biotech Ltd.

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Kombination von Größenausschlusschromatographie mit Multi-Winkel-Lichtstreuung (SEC-MALS) zur absoluten Charakterisierung von Proteinen und Komplexen in Lösung. SEC-MALS bestimmt das Molekulargewicht und die Größe reiner Proteine, nativer Oligomere, Heterokomplexe und modifizierter Proteine wie Glykoproteine.

Abstract

Die analytische Größenausschlusschromatographie (SEC), die häufig zur Bestimmung des Molekulargewichts von Proteinen und Protein-Protein-Komplexen in Lösung verwendet wird, ist eine relative Technik, die sich auf das Elutionsvolumen des Analyten stützt, um molekulare gewicht. Wenn das Protein nicht kugelförmig ist oder nicht-ideale Säulenwechselwirkungen durchläuft, ist die Kalibrierkurve auf der Grundlage von Proteinstandards ungültig, und das aus dem Elutionsvolumen ermittelte Molekulargewicht ist falsch. Multi-Winkel-Lichtstreuung (MALS) ist eine absolute Technik, die das Molekulargewicht eines Analyten in Lösung aus grundlegenden physikalischen Gleichungen bestimmt. Die Kombination von SEC zur Trennung mit MALS zur Analyse stellt ein vielseitiges, zuverlässiges Mittel zur Charakterisierung von Lösungen einer oder mehrerer Proteinarten dar, einschließlich Monomeren, nativen Oligomeren oder Aggregaten und Heterokomplexen. Da die Messung bei jedem Elutionsvolumen durchgeführt wird, kann SEC-MALS bestimmen, ob ein eluierender Peak homogen oder heterogen ist, und zwischen einer festen Molekulargewichtsverteilung im Vergleich zum dynamischen Gleichgewicht unterscheiden. Die Analyse modifizierter Proteine wie Glykoproteine oder Lipoproteine oder Konjugate wie Waschmittel-solubilisierte Membranproteine ist ebenfalls möglich. Daher ist SEC-MALS ein wichtiges Werkzeug für den Proteinchemiker, der die biophysikalischen Eigenschaften und das Lösungsverhalten von Molekülen bestätigen muss, die für die biologische oder biotechnologische Forschung produziert werden. Dieses Protokoll für SEC-MALS analysiert das Molekulargewicht und die Größe reiner Proteinmonomere und -aggregate. Die gewonnenen Daten dienen als Grundlage für weitere SEC-MALS-Analysen, einschließlich der von Komplexen, Glykoproteinen und Tensid-gebundenen Membranproteinen.

Introduction

Eine zuverlässige Analyse des Molekulargewichts (MW) von Proteinen in Lösung ist für die biomolekulare Forschung^{unerlässlich 1}^,²^,³^,⁴. Die MW-Analyse informiert den Wissenschaftler, ob das richtige Protein hergestellt wurde und ob es für weitere Experimente geeignet ist⁵^,⁶. Wie auf den Websites der Proteinforschungsnetze P4EU⁷ und ARBRE-Mobieu⁸beschrieben, muss die Proteinqualitätskontrolle nicht nur die Reinheit des Endprodukts, sondern auch seinen oligomeren Zustand, Homogenität, Identität, Konformation, Struktur, Post-Translation-Änderungen und andere Eigenschaften.

Die MW-Messung in einer nicht-denaturierenden Lösung identifiziert die Form des Proteins, das in einer wässrigen Umgebung vorhanden ist, ob monomer oder oligomer. Während für viele Proteine das Ziel darin besteht, die monomere Form zu produzieren, ist für andere ein spezifischer einheimischer Oligomer der Schlüssel zur biologischen Aktivität⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹². Andere Oligomere und nicht native Aggregate sind unerwünscht und führen zu Fehlern in der strukturalen Bestimmung durch Kristallographie, Kernspinresonanz (NMR) oder kleinwinkelige Röntgenstreuung sowie Artefakte oder Ungenauigkeiten in funktionellen Quantifizierung der Bindung durch isothermale Titrationskallorimetrie oder Oberflächenplasmonresonanz²^,¹³.

Bei Biotherapeutika wie monoklonalen Antikörpern (mAbs) dient die lösungsbasierte MW-Analyse einem ähnlichen Zweck der Qualitätskontrolle und Produktcharakterisierung. Übermäßige Aggregate und Fragmente deuten auf ein instabiles Produkt hin, das nicht für den menschlichen Gebrauch geeignet ist. Regulierungsbehörden erfordern eine sorgfältige Charakterisierung, nicht nur des therapeutischen Moleküls, sondern auch potenzieller Abbaumittel, die im Endprodukt^14,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷vorhanden sein können.

Zu den am weitesten verbreiteten Methoden zur Analyse von Protein MW gehören Natriumdodecylsulfat Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), Kapillarelektrophorese (CE), native PAGE, Massenspektrometrie (MS), Größenausschlusschromatographie (SEC) und analytische Ultrazentrifugation (AUC). Von diesen werden SDS-PAGE, CE und MS nicht im nativen Zustand durchgeführt und führen in der Regel zur Dissoziation von Oligomeren und Aggregaten, daher sind sie nicht geeignet, den nativen Oligomer zu bestimmen oder Aggregate zu quantifizieren. Obwohl native PAGE theoretisch den nativen Zustand behält, ist es unserer Erfahrung nach schwierig, für viele Proteine zu optimieren, und die Ergebnisse sind nicht sehr zuverlässig. AUC, sei es durch Sedimentationsgeschwindigkeit oder Sedimentationsgleichgewicht, ist quantitativ und kann MW aus ersten Prinzipien bestimmen, aber es ist ziemlich umständlich, erfordert viel manuelle Arbeit und erhebliche seranische Expertise in der Dateninterpretation, lange Experimentierzeit und ein sehr teures Instrument.

Analytical SEC ist eine quantitative und relativ robuste, einfache Methode, die Makromoleküle während des Durchflusses durch eine gepackte Säule trennt. Die Prinzipien und Anwendungen der SEC sind in mehreren Rezensionen gut dargestellt¹⁸^,¹⁹^,²⁰ und im Handbuch “GrößenausschlussChromatographie: Prinzipien und Methoden”²¹. Die Unterschiede in der Retention sind auf unterschiedliche Zeitaufwand zurückzuführen, die in der stationären Phase in die poren und aus den Poren verteilt werden, bevor sie vom Ende der Kolonne eluiert werden. Die Unterschiede ergeben sich (nominal) aus den relativen Größen und Diffusionskoeffizienten der Moleküle²². Eine Kalibrierkurve wird mit einer Reihe von Referenzmolekülen erstellt, die die MW des Moleküls mit dem Elutionsvolumen in Beziehung setzt. Bei Proteinen sind die Referenzmoleküle im Allgemeinen gut erzogene, kugelförmige Proteine, die nicht über Ladung oder hydrophobe Oberflächenrückstände mit der Säule interagieren. Das Elutionsvolumen wird mit einem ultravioletten (UV) Absorptionsdetektor gemessen. Wenn der UV-Aussterbekoeffizient bekannt ist-oft aus der Sequenz berechnet – kann auch die Proteinspitzengesamtmasse quantifiziert werden.

Insbesondere beruht die Analyse von MW durch die SEC auf zwei wesentlichen Annahmen in Bezug auf die zu kennzeichnenden Proteine: 1) sie teilen mit den Referenzstandards die gleiche Konformation und das spezifische Volumen (d. h. die gleiche Beziehung zwischen Diffusionseigenschaften und MW) und 2) wie die Referenznormen interagieren sie nicht mit der Säule, außer durch sterische Eigenschaften – sie halten sich nicht per Ladung oder hydrophobe Wechselwirkungen an die Säulenverpackung. Abweichungen von diesen Annahmen entkräften die Kalibrierkurve und führen zu fehlerhaften MW-Bestimmungen. Dies gilt für intrinsisch ungeordnete Proteine, die aufgrund ihrer ausgedehnten unstrukturierten Regionen^23,²⁴ oder nicht-sphärische/lineare oligomere Baugruppen¹⁰große Stokesradien haben. Glykosylierte Proteine haben in der Regel einen größeren Stokes-Radius als die nicht-glykosylierte Form, selbst wenn die zugesetzte Kohlenhydratmasse berücksichtigt wird¹⁹. Waschmittel-solubilisierte Membranproteine sind anders als Kalibrierproteine, da ihre Elution aus DER SEC von der Gesamtgröße des Polypeptid-Detergenzien-Lipid-Komplexes und nicht vom oligomeren Zustand und der Molmasse des Proteins 25 abhängt. ^,²⁶. Säulenchemie, pH- und Salzbedingungen beeinflussen alle Dieeretionsmengen von Proteinen mit geladenen oder hydrophoben Oberflächenrückständen²⁷^,²⁸.

SEC wird viel vielseitiger und zuverlässiger für die MW-Bestimmung in Kombination mit Multi-Winkel-Lichtstreuung (MALS) und Differential Brechungsindex (dRI) Detektoren³^,⁴^,¹¹^,²⁹^, ³⁰^,³¹^,³². Ein dRI-Detektor bestimmt die Konzentration basierend auf der Veränderung des Lösungsrefraktiven Index es aufgrund des Vorhandenseins des Analyten. Ein MALS-Detektor misst den Anteil des Lichts, das durch einen Analyten in mehrere Winkel im Verhältnis zum einfallenden Laserstrahl gestreut wird. Zusammen bekannt als SEC-MALS, bestimmt diese Instrumentierung MW unabhängig von der Elutionszeit, da MW direkt aus den ersten Prinzipien anhand von Gleichung 1 berechnet werden kann,

①

wobei M das Molekulargewicht des Analyten, R(0) das reduzierte Rayleigh-Verhältnis (d. h. die vom Analyten im Verhältnis zur Laserintensität gestreute Lichtmenge) ist, die vom MALS-Detektor bestimmt und auf Winkel Null extrapoliert wird, c Gewichtskonzentration, die durch den UV- oder dRI-Detektor bestimmt wird, dn/dc das Brechungsindex-Inkrement des Analyten (im Wesentlichen die Differenz zwischen dem Brechungsindex des Analyten und des Puffers) und K eine optische Konstante, die von der Systemeigenschaften wie Wellenlänge und Lösungsmittelbrechungsindex²⁹.

In SEC-MALS wird die SEC-Säule ausschließlich verwendet, um die verschiedenen Arten in Lösung zu trennen, so dass sie einzeln in die MALS- und Konzentrationsdetektorzellen gelangen. Die tatsächliche Retentionszeit hat für die Analyse keine Bedeutung, außer wie gut sie die Proteinarten auflöst. Die Instrumente sind unabhängig von der Säule kalibriert und stützen sich nicht auf Referenzstandards. Daher gilt SEC-MALS als “absolute” Methode zur MW-Bestimmung aus grundlegenden physikalischen Gleichungen. Wenn die Probe heterogen ist und nicht vollständig durch die Spalte getrennt ist, dann ist der bei jedem Elutionsvolumen angegebene Wert ein Gewichtsdurchschnitt der Moleküle in jedem Elutionsvolumen, das durch die Durchflusszelle pro Zeitscheibe fließt, etwa 75 l.

Durch die Analyse der Winkelvariation der Streuintensität kann MALS auch die Größe (Wurzel-Mittel-Quadratradius, Rg) von Makromolekülen und Nanopartikeln mit einem geometrischen Radius von mehr als etwa 12,5 nm²⁹bestimmen. Für kleinere Arten wie monomere Proteine und Oligomere kann dem MALS-Instrument ein dynamisches Lichtstreuungsmodul (DLS) hinzugefügt werden, um hydrodynamische Radien von 0,5 nm bis³³zu messen.

Während entweder die UV- oder dRI-Konzentrationsanalyse den Wert von c in Eq. 1 liefern kann, wird die Verwendung von dRI aus zwei Gründen bevorzugt: 1) dRI ist ein universeller Konzentrationsdetektor, der für die Analyse von Molekülen wie Zuckern oder Polysacchariden geeignet ist, die keine UV- Chromophor³⁴; und 2) die Konzentrationsreaktion dn/dc fast aller reinen Proteine im wässrigen Puffer ist gleich bei einem oder zwei Prozent (0,185 ml/g)³⁵, so dass es nicht notwendig ist, den UV-Aussterbekoeffizienten zu kennen.

Der Einsatz von SEC-MALS in der Proteinforschung ist recht umfangreich. Bei weitem die häufigsten Anwendungen sind festzustellen, ob ein gereinigtes Protein monomer oder oligomer ist und der Grad der Oligomerisierung, und die Bewertung der Aggregate³^,¹⁰^,¹¹^,¹⁷^, ³¹^,³⁶^,³⁷^,³⁸. Die Möglichkeit, dies für Waschmittel-solubilisierte Membranproteine zu tun, die nicht durch traditionelle Mittel gekennzeichnet werden können, ist besonders geschätzt, und detaillierte Protokolle dafür wurden veröffentlicht³¹^,³⁹^,⁴⁰ ^, ⁴¹ ^, ⁴² ^, ⁴³. Weitere häufige Anwendungen sind die Festlegung des Grades der posttranslationalen Modifikation und Polydispersität von Glykoprotein, Lipoproteinen und ähnlichen Konjugaten⁴^,³¹^,⁴⁴ ^, ⁴⁵ ^, ⁴⁶ ^, ⁴⁷; die Bildung (oder das Fehlen davon) und die absolute Stoichiometrie (im Gegensatz zum stoichiometrischen Verhältnis) von Heterokomplexen, einschließlich Protein-Protein, Protein-Nukleinsäure und Protein-Polysaccharid-Komplexe²⁴^,⁴⁶^, ⁴⁸^,⁴⁹^,⁵⁰^,⁵¹^,⁵²; Bestimmung der Monomer-Dimer-Gleichgewichtsdissoziationskonstante⁴⁹^,⁵³^,⁵⁴; und Bewertung der Proteinkonformation⁵⁵^,⁵⁶. Neben Proteinen ist SEC-MALS von unschätzbarem Wert für die Charakterisierung von Peptiden⁵⁷^,⁵⁸, breit heterogene natürliche Polymere wie Heparine⁵⁹ und Chitosane⁶⁰^,⁶¹, kleine Viren⁶² und die meisten Arten von synthetischen oder verarbeiteten Polymeren⁶³^,⁶⁴^,⁶⁵^,⁶⁶. Eine umfangreiche Bibliographie findet sich in der Literatur⁶⁷ und online (bei http://www.wyatt.com/bibliography).

Hier stellen wir ein Standardprotokoll zum Ausführen und Analysieren eines SEC-MALS-Experiments vor. Rinderserumalbumin (BSA) wird als Beispiel für die Trennung und Charakterisierung von Proteinmonomeren und Oligomeren präsentiert. Das BSA-Protokoll bestimmt bestimmte Systemkonstanten, die als Grundlage für weitere SEC-MALS-Analysen dienen, einschließlich der von Komplexen, Glykoproteinen und Tensid-gebundenen Membranproteinen.

Wir weisen darauf hin, dass SEC-MALS mit Standard-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) oder schnellen Protein-Flüssigkeitschromatographie (FPLC) Geräten von vielen Anbietern durchgeführt werden kann. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines FPLC-Systems, das häufig in Labors vorgefunden wird, die Proteine für Forschung und Entwicklung produzieren (siehe Tabelle der Materialien). Vor dem Betrieb des Protokolls sollten das FPLC-System, MALS- und dRI-Detektoren zusammen mit den entsprechenden Softwarepaketen zur Steuerung, Datenerfassung und -analyse nach Herstelleranweisungen und allen erforderlichen Kalibrierkonstanten installiert worden sein. oder andere Einstellungen, die in die Software eingegeben wurden. Zwischen Pumpe und Injektor sollte ein Inline-Filter mit einer hydrophilen, 0,1 m Porenmembran platziert werden.

Protocol

1. Vorbereitung des Systems Schließen Sie die MALS- und dRI-Detektoren nach dem UV-Detektor des FPLC an. Umgehen Sie den pH- und Leitfähigkeitsdetektor, da sie ein signifikantes Interdetektorvolumen zwischen den UV- und MALS-Detektoren hinzufügen. Verwenden Sie Kapillarschläuche von 0,25 mm i.d. von der Säule zu und zwischen den Detektoren und 0,75 mm i.d. Kapillarschläuche am Ausgang der Detektoren zum Abfall- oder Fraktionssammler. Stellen Sie sicher, dass die notwendigen Signalverbindungen zwischen dem FPLC und den Detektoren hergestellt wurden, einschließlich analoger Ausgang vom UV-Detektor zum ANALOGen MALS-Eingang und digitaler Ausgang vom FPLC zur MALS-Autoinjekung über die I/O-Box des FPLC. Installieren Sie eine geeignete analytische SEC-Säule mit einem Fraktionierungsbereich von mindestens 20 kDa bis 500 kDa. Überprüfen Sie die Produktinformationen, um festzustellen, ob die Säule für den Bereich von MW, pH und anderen Eigenschaften der Probe und der mobilen Phase geeignet ist. 2. Vorbereitung des Puffers, Übernachtdes des Systems und Überprüfung der Sauberkeit Mit HPLC-reagenzien 1 L phosphatgepufferte Saline mit 50 – 100 mM NaCl zubereiten. Filtern Sie den Puffer mit einem Flaschen-Top-Polyether-Sulfonfilter oder ähnlichem auf 0,1 m. Filtern Sie die ersten 50-100 ml Puffer in eine Abfallflasche und entsorgen Sie sie, um Partikel aus den Trockenfiltern zu entfernen, und filtern Sie den Rest dann in eine saubere, sterile Flasche, die gründlich mit gefiltertem, entionisiertem Wasser gewaschen und verkappt wurde, um Staub aus dem Eindringen.HINWEIS: Andere mobile Phasenlösungsmittel wie ein Tris-Puffer können verwendet werden, wenn zusätzliche Proteine analysiert werden sollen, die bevorzugt in diesen Lösungsmitteln gelöst werden. Über Nacht mit einer Durchflussrate von 0,5 ml/min oder, wie vom Säulenhersteller anderweitig empfohlen, spülen, um die Säule im Puffer auszustatten und Partikel zu entfernen. Verwenden Sie den kontinuierlichen Durchflussmodus des FPLC und stellen Sie sicher, dass der Flow erst beendet wird, wenn alle SEC-MALS-Ausführungen abgeschlossen sind. Platzieren Sie die dRI-Flusszelle während der Nachtspülung im Purge-Modus. Deaktivieren Sie die Bereinigung, bevor Sie mit dem Beispiellauf beginnen. Wenn Sie mit der Spülung beginnen, fahren Sie nach und nach die Durchflussrate an, um einen “Spaltenabwurf”-Effekt (oder die Freisetzung von Partikeln) zu verhindern, der durch eine plötzliche Druckänderung in der Säule verursacht wird. Wenn das System bekanntlich recht stabil und partikelfrei ist und im Gleichgewicht mit der gewünschten mobilen Phase, ersetzen Sie die Nachtspülung durch eine kürzere, 2-3 h Spülung. Überprüfen Sie die Sauberkeit des Systems, indem Sie die Schläuche nach der Säule leicht anzapfen, um angesammelte Partikel freizusetzen, und beobachten Sie das Signal im 90°-Detektor auf der Frontplatte des MALS-Instruments. Stellen Sie sicher, dass das Peak-to-Peak-Rauschen nicht mehr als 50 -100 V beträgt. Führen Sie eine “leere” Injektion durch, um zu überprüfen, ob der Injektor von Partikeln gereinigt ist. Ein “Leerlauf” ist einfach der Laufpuffer, der in einer frischen, sterilen Durchstechflasche zubereitet wird. Wenn der Partikelspitzenwert nicht mehr als 1 ml Volumen und nicht mehr als 5 mV über dem Ausgangswert liegt, ist das System für Proben bereit. Andernfalls führen Sie zusätzliche Leerinjektionen bis zur Reinigung durch oder führen Sie Wartungsarbeiten durch, um den Injektor zu reinigen. 3. Vorbereiten und Laden der Probe Bereiten Sie mindestens 200 l BSA bei 1-2 mg/ml im SEC-Puffer vor.HINWEIS: Um Fällung zu verhindern, sollte BSA niemals in reinem Wasser gelöst werden. Filtern Sie das Protein mit einem Spritzenspitzenfilter auf 0,02 m. Entsorgen Sie die ersten Tropfen Filtrat, um Partikel aus den Trockenfiltern zu entfernen. Alternativ zentrifugieren Sie die Probe bei 10.000 x g für 15 min, um die Ausfällung von nicht löslichen Aggregaten und anderen großen Partikeln zu ermöglichen. Injizieren Sie 100 l der BSA-Lösung in die Schleife.HINWEIS: Dies ist die empfohlene Materialmenge, und mehr oder weniger kann je nach den Umständen der Probe wie Stabilität oder Verfügbarkeit injiziert werden. Die Menge des pro Injektion benötigten Proteins variiert umgekehrt mit dem Molekulargewicht – doppelt so viel Proteinmasse wird benötigt, wenn das Molekulargewicht 33 kDa oder halb so hoch ist wie die von BSA. 4. Vorbereitung der MALS-Software Öffnen Sie Neu | Experimentieren Sie im MALS-Softwaremenü aus Methode, und wählen Sie die Online-Methode aus dem Ordner Light Scattering System methods aus. Wenn ein DLS-Detektor vorhanden ist, wählen Sie die Online-Methode aus dem Lichtstreuung | Mit QELS-Ordner. Legen Sie im Abschnitt Konfiguration die Parameter der Beispiel- und der mobilen Phase fest. Legen Sie in der Ansicht Generische Pumpe den Durchfluss auf den im FPLC verwendeten Satz fest. Wählen Sie in der Ansicht Generische Pumpe, Lösemittelzweig, Name-Feld PBSaus. Geben Sie in der Injektoransicht Sample-Zweig den Namen als BSAein, und legen Sie dn/dc = 0,185 (Standardwert für unveränderte Proteine), A2 = 0 und UV-Aussterbekoeffizient = 0,667 ml/(mg-cm) fest.HINWEIS: Bei anderen Proteinen kann der UV280 nm Aussterbekoeffizient in der Literatur gefunden oder aus seiner Sequenz mit verschiedenen public-domain Software-Tools berechnet werden. Aktivieren Sie im Abschnitt Prozeduren, Ansicht “Basisauflistung”, das Kontrollkästchen Auslösen bei der automatischen Einspritzung, und legen Sie die Dauer des Durchlaufs auf 70 minuten fest, sodass Daten für die gesamte Elution bis zum Gesamtpermeationsvolumen der SEC gesammelt werden. Spalte erreicht ist.HINWEIS: Die erforderliche Zeit kann je nach Säule und Durchflussrate variieren – 35 min Der Sammlung sind für eine Standard-HPLC-SEC-Säule von 7,8 mm x 300 mm bei 0,5 mL/min erforderlich. Starten Sie das Experiment in der MALS-Software, indem Sie auf die Schaltfläche Ausführen klicken. Es beginnt, die Daten zu lesen, nachdem es das Impulssignal vom FPLC-Instrument über den MALS-Detektor empfangen hat. Null das dRI-Signal, indem Sie auf die AutoZero-Schaltfläche auf der Vorderseite des Instruments klicken. 5. Erstellung der FPLC-Software Fügen Sie den Namen des Proteins und den Lauf in die FPLC-Software ein, in Manual | Manuelle Anweisungen ausführen | Markierung setzen. Schalten Sie das Einspritzventil von der manuellen Last auf Injekung unter Durchflussweg | Einspritzventil. Ein Impulssignal durch Einsetzen eines 0,5 s Impulses unter der I/O-Box | Puls digital aus. Dadurch wird die Datenerfassung in der MALS-Software ausgelöst. 6. Injizieren Sie die Probe in die Schleife. Klicken Sie in der FPLC-Software auf Ausführen, um den Experimentlauf zu starten. 7.Analyse von SEC-MALS BSA-Daten Führen Sie die Analyse Schritt für Schritt im Abschnitt Prozeduren in der MALS-Software durch. Stellen Sie sicher, dass Spitzen bei ungefähr demselben Elutionsvolumen in UV, MALS und RI angezeigt werden, indem Sie die Ansicht “Basic Collection” überprüfen. Definieren Sie in der Baseline-Ansicht die Basislinie für alle Signale (alle LS-Detektoren, UV und dRI). Die Basislinien sollten definiert werden, um den Gehalt an reinem Lösungsmittel anzugeben, vorzugsweise von einer Seite der Probenspitzen zur anderen. Definieren Sie in der Peaks-Ansicht die zu analysierenden Spitzen, indem Sie mit der Maus klicken und ziehen. Wählen Sie die zentralen 50 % jedes Peaks aus. Wählen Sie zuerst den Monomer-Peak (“Peak 1”) und dann den Dimer-Peak (“Peak 2”) aus. Überprüfen Sie die korrekten Werte von dn/dc = 0,185 und UV 280 nm Aussterbekoeffizient = 0,667 für BSA unter jedem Peak. Führen Sie Peak-Alignment-, Band-Broadening-Korrektur- und Normalisierungsverfahren durch.ANMERKUNG: Normalerweise wird die SEC-MALS-Methode periodisch für Spitzenausrichtung, Bandverbreiterung und Normalisierung der Winkeldetektoren auf den 90°-Detektor mit einem monodispersen Protein mit Kreisradius Rg < 10 nm wie BSA kalibriert. Monomer. In diesem Beispiel dient BSA sowohl als Kalibriermolekül als auch ist selbst Gegenstand der MW-Analyse. In den Verfahren | Ausrichtungsansicht, wählen Sie den zentralen Bereich der Spitzen durch Klicken und Ziehen der Maus, klicken Sie auf Signale ausrichten und dann OK. In den Verfahren | Band Broadening Ansicht, wählen Sie die zentrale 50% der Monomer Spitze. Stellen Sie sicher, dass der RI-Detektor als Referenzinstrumentangegeben ist, und klicken Sie dann auf Anpassen und Anwenden, um die UV- und LS-Signale an das RI-Signal anzupassen. Zoomen Sie auf die Spitzen, um zu überprüfen, ob sie sich sehr eng innerhalb der zentralen 50-70% überlappen, und klicken Sie dann auf OK. Wenn die Überlappung nicht perfekt ist, (kann es notwendig sein,) führen Sie die Anpassung und “Anwenden” ein oder zwei weitere Male, bis die Überlappung ausgezeichnet ist. In den Verfahren | Normalisierungsansicht, wählen Sie Peak 1, geben Sie 3,0 nm als R g-Wert ein, klicken Sie auf Normalisieren und dann OK. In den Verfahren | Molar Mass und Rg aus MALS-Ansicht, überprüfen Sie die Daten, um festzustellen, welche, falls vorhanden, Erkennungswinkel aus der Analyse aufgrund übermäßigen Rauschens deaktiviert werden sollten. Typischerweise sind dies die unteren Winkel, in die Staubpartikel eine relativ hohe Intensität streuen. Wählen Sie einzelne Slices innerhalb der Spitzen aus dem Diagramm auf der rechten Seite aus und zeigen Sie die Winkelabhängigkeit des inversreduzierten Rayleigh-Verhältnisses im Diagramm auf der linken Seite an. Wenn die niedrigsten (und manchmal die höchsten) Winkel ständig stark von der Anpassung abweichen, deaktivieren Sie sie von der Liste am unteren Rand der Ansicht. Zeigen Sie das Diagramm der Ergebnisse in der EASI-Diagrammansicht an. Wählen Sie Molar Mass aus der Dropdown-Liste Display oben im Fenster aus. Verwenden Sie Strg + Klicken und Ziehen, um den Spitzenbereich zu vergrößern. Sehen Sie sich die endgültigen tabellarischen gewichtsdurchschnittlichen Molarenmassenergebnisse für die Monomer- und Dimerspitzen in den Ergebnissen | Berichtsansicht (Zusammenfassung) unter Spitzenergebnisse | Molmassenmomente (g/mol) | Mw. Reinheit wird unter Peak Results berichtet | Massenfraktion(%).HINWEIS: Es werden auch andere Molmassenmomente angezeigt; Diese sind in der Regel für heterogene Polymere relevant, nicht aber für Proteine mit diskreten Größen. Viele andere Ergebnisse, die von der Software produziert werden, können in den Bericht aufgenommen werden, wie z. B. prozentuale Massenrückgewinnung (der Anteil des Proteins, der über den Konzentrationsdetektor relativ zur injizierten Menge eluierte), Spitzenstatistiken, Polydispersität, Rg und Rh Momente, etc. Wenn angegeben, spiegeln die Unsicherheitsmaße die Genauigkeit des angegebenen Wertes wider, der auf der Grundlage des Rauschens innerhalb der Messreihe angegeben wird, und sollten nicht als die Genauigkeit angesehen werden. Die wahre Genauigkeit der gemeldeten Werte hängt von verschiedenen Faktoren ab, wie z. B. der Genauigkeit der angegebenen dn/dc- und Aussterbekoeffizientenwerte, der Gerätekalibrierung usw. Wählen Sie im Menü Datei die Option Als Methode speichern aus und speichern Sie die analysierten BSA-Daten als Standardmethode für zukünftige Messungen aller Proteinarten. Die für BSA ermittelten Normalisierungs- und Banderweiterungsparameter werden in der Analyse übernommen.

Representative Results

Abbildung 1a,b zeigen, dass drei oligomere Formen von BSA: Monomer, Dimer und Trimer, auf der Porensäule 200 mit Einer Grundauflösung von Monomer und Dimer gut getrennt waren, während Abbildung 2a zeigt, dass die Trennung auf einer 75-Zoll-Porensäule nicht eine gute Monomer-Dimer-Auflösung zu erzielen. Das letztgenannte Beispiel wurde aufgenommen, um ein “schlechtes” Ergebnis zu veranschaulichen; diese Trennungsunterschiede für die beiden Säulen sind in der Tat entsprechend den angegebenen Trennbereichen des Herstellers zu erwarten. Der Trimmer ist nicht vollständig vom Dimer getrennt und höhere Oligomere sind nicht gut vom Trimmer und voneinander getrennt. Abbildung 2b ist ein Beispiel für ein lautes Lichtstreusignal mit Partikeln, die im gesamten Chromatogramm vorhanden sind, was eine genaue MW-Bestimmung ausschließt. Von nun an konzentrieren wir uns auf Abbildung 1b. Das Monomer, das mit 13,8 ml eluierte, weist eine gewichtsdurchschnittliche Molmasse Mw von 64,1 x 0,4 kDa auf, die durch MALS und den hydrodynamischen Radius Rh von 3,54 x 0,01 nm bestimmt wird. Diese Ergebnisse stehen im Einvernehmen mit der Sequenzmasse und dem bekannten hydrodynamischen Radius von BSA, 66,4 kDa bzw. 3,5 nm bzw.68, bis zur üblichen Genauigkeit von SEC-MALS, 5%3,69. Der Dimer, der bei 12 ml eluierte, wies einen M w-Wert von 127 x 1 kDa auf, der wie erwartet von MALS-bestimmt wurde, doppelt so viel wie der des Monomers bis zu einer experimentellen Präzision – und Rh von 5,68 x 0,06 nm. Die Trimmerspitze wurde auch bei 11 ml mit Mw von 194 x 9 kDa von MALS bestimmt, dreimal so hoch wie erwartet in experimenteller Präzision. R h des Trimmers konnte aufgrund der geringen Intensität des DLS-Signals nicht bestimmt werden. Die über den Monomer-Peak berechneten Molmassenpunkte liegen gleichmäßig bei 2-5%, was auf Homogenität hindeutet. Es ist nicht ungewöhnlich, eine nachgestellte Schulter mit Molmasse im Bereich von 38-50 kDa zu finden, entsprechend BSA-Fragmenten70. Die molaren Massepunkte über die dimerischen und trimeren Gipfel sind nicht einheitlich, was auf Heterogenität hindeutet. Der Dimer-Peak ist aufgrund von Spuren von Trimer, die in den Dimer-Peak bluten, etwas heterogen, und der Trimmer-Peak ist heterogen aufgrund der Ko-Elution von schlecht aufgelösten höheren Oligomeren. Der Signal-Rausch-Pegel der Monomerspitze ist in allen drei Signalen über 100:1 durchaus akzeptabel, ebenso wie die Dimer-Peak mit Signal-to-Noise von 40:1. Chromatogrammregionen außerhalb der Proteinspitzen sind flach, mit Ausnahme eines Peaks aufgrund von Partikeln in der Nähe des gesamten Ausschlussvolumens (void) in der LS-Spur und einer (positiven) Salzspitze und einer (negativen) gelösten Luftspitze in der dRI-Spur, in der Nähe der Gesamtdurchlässigkeit Volumen. Diese sind in Abbildung 1adargestellt. Reinheitsgrad kann auch in einem SEC-MALS-Experiment berechnet werden: Massenanteil des monomeren Peaks im Bericht stellt den Reinheitsprozentsatz der monomeren Form dar. Bei BSA-Monomer beträgt die berechnete Reinheit 88 %. Abbildung 1 : SEC-MALS-Analyse von Rinderserumalbumin (BSA) unter Verwendung einer Spalte mit einer Porengröße und Einem Ausschluss von 200 %. Chromatogrammspuren werden bis zur Monomerspitze normalisiert und aus Gründen der Übersichtlichkeit versetzt. (A) Häufige Artefakte, die ignoriert werden können, werden darauf hingewiesen, einschließlich eines Partikelspitzen in der Nähe des Anfangs des Lichtstreusignals sowie Salz- und gelöster Luftspitzen in der Nähe des gesamten Permeationsvolumens im Brechungsindexsignal. (B) Das Chromatogramm weist eine hervorragende Monomer-Dimer-Trimer-Trennung auf und das Lichtstreusignal weist ein hohes Signal-zu-Rauschen auf. Die Monomer- und Dimer-MW-Werte weisen eine hohe Homogenität auf. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2 : Beispiele für minderwertige SEC-MALS-Analysen. Chromatogrammspuren werden bis zur Monomerspitze normalisiert und aus Gründen der Übersichtlichkeit versetzt. (A) Unzureichende Trennung auf einer 75-Zoll-Sperrspalte; ein Teilchenspitzen zwischen 8 – 9 min ist nicht gut von den Proteinen getrennt. (B) Unzureichendes Signal-Rausch-Verhältnis und umfangreiche Partikel neben den Proteinen sind im Lichtstreusignal (LS) zu erkennen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Das SEC-MALS-Experiment hat eine gute Trennung von Monomer, Dimer und Trimer und quantitative Ergebnisse für die Molmassen und hydrodynamischen Größen jedes Peaks geliefert. Dies wiederum identifiziert und charakterisiert jede vorhandene Art klar und quantifiziert die Reinheit. In der Regel sind die erhaltenen Ergebnisse innerhalb von 5% genau und präzise und wiederholbar bis innerhalb von 1-2%³^,⁶⁹. Diese Genauigkeit und Wiederholbarkeit ermöglicht es, sicher zwischen Arten zu unterscheiden, die in MW nahe sein können, solange sie durch SEC getrennt sind (kann sich teilweise innerhalb desselben Peaks überlappen). Die Vorteile der Proteinqualitätskontrolle und der grundlegenden biophysikalischen Charakterisierung liegen auf der Hand.

Die Überprüfung des Fehlens von Partikeln ist für empfindliche, wiederholbare SEC-MALS-Messungen sehr wichtig. Partikelspitzen erscheinen in der Regel als große MALS-Signale, die von vergleichbaren UV- oder RI-Signalen begleitet werden. Die mobile Phase und Probe sollte sorgfältig vorbereitet werden, um solche Partikel zu beseitigen. Verwendung von HPLC-reagenzien oder besser, Filtration von mobilen Phasen- und Verdünnungspuffern auf 0,1 – 0,2 m (Vorwäsche des Filters zur Beseitigung von Partikeln, die immer auf trockenen Membranen vorhanden sind), Wartung von extra-sauberen mobilen Phasenflaschen und anderen Glaswaren für ES wird empfohlen, SEC-MALS und eine erweiterte Säulenägleichdquilibration unter Strömung (zur Entfernung von Partikeln und Aggregaten, die sich möglicherweise angesammelt haben, wenn der Fluss angehalten wurde oder eine Spalte nicht verwendet wird) zu entfernen. Die Probe sollte auf die kleinste Porengröße gefiltert werden, die das Material von Interesse nicht entfernt, in der Regel nicht größer als 0,1 m und, wenn möglich, 0,02 m. Wenn der Filter schnell verstopft, kann die Probe zentrifugiert, in Stufen absteigender Porengröße gefiltert und/oder neu gereinigt werden. Wenn Systeme konsequent mit hochwertigen, frischen und gefilterten mobilen Phasen gewartet werden, Säulenschocks verhindert werden, Proben sauber sind und nicht an der Säule haften, zeigen die Messungen nicht den oben genannten Partikellärm und qualitativ hochwertige Daten.

MALS ist agnostisch zu typischen SEC-Puffern für Proteine; viele andere Puffersysteme neben PBS können verwendet werden, um Trennung und Stabilität zu optimieren, einschließlich einer Vielzahl von Hilfsstoffen⁷¹. MALS ist auch agnostisch für die spezifische Spalte, die für eine optimale Trennung und Wiederherstellung ausgewählt werden sollte. Die Hauptsorgen für Hilfsstoffe in Bezug auf die Analyse sind signifikante Veränderungen des Brechungsindexes, die zur Änderung des spezifischen Brechungsindexinkrements dn/dcführen, und Hilfsstoffe, die 280 nm absorbieren, wenn eine UV-Analyse erforderlich ist. Zum Beispiel ist Arginin ein gemeinsamer aggregationsreduzierender Hilfsstoff, der den dn/dc eines typischen Proteins dramatisch beeinflussen und es sogar in das negative Regime bringen kann (ein Protein mit negativem dn/dc kann immer noch von SEC-MALS analysiert werden, wenn dn/ dc wird empirisch bestimmt, aber wenn dn/dc = 0 die Intensität des Lichts, das vom Protein gestreut wird, null ist und die MW-Analyse unmöglich ist). Das Thema dn/dc-Werte für Proteine wird von Zhao et al.³⁵ ausführlich diskutiert, wo gezeigt wird, dass bei standardwäsrigen Puffern die überwiegende Mehrheit der unmodifizierten Proteine innerhalb von 2-3% des Standardwertes liegt (0,185 oder 0,186 ml/g bei = 660 nm) , obwohl Proteine unter 10 kDa variabler sind, und es gibt einige Arten, die bis zu 0,21 ml/g gehen können.

Die MW-Profile in den BSA-Monomer- und Dimerspitzen in den dargestellten Daten waren beide recht homogen bis zu 2 % oder weniger, was auf monodisperse Arten hindeutet. Uneinheitliche MW-Werte über einen Spitzenwert hinweg können durch Heterogenität oder unsachgemäße Analyse entstehen. Insbesondere könnte ein BSA-MW-Profil, das konkav (“Lächeln”) oder konvex (“Grimace”) ist, ergeben, dass die Banderweiterungskorrektur nicht korrekt angewendet wird. Bei anderen Proteinen könnte ein konvexes Profil auch aus dem dynamischen Gleichgewicht zwischen Monomeren und Oligomeren entstehen, wobei das Verhältnis von Monomer zu Oligomer – und damit der scheinbare MW-Wert – von der Spitzenkonzentration abhängt (BSA weist dieses Verhalten nicht auf und wird häufig verwendet). als Kontrollbeispiel zur Überprüfung korrekter Banderweiterungsparameter). Ein MW-Profil, das von der führenden bis zur hinteren Kante variiert und sich mit der Probenkonzentration nicht ändert, ist typisch für eine Verteilung von Molekulargewichtsarten, die teilweise von SEC gelöst werden. Dynamisches Gleichgewicht unterscheidet sich leicht von den anderen Quellen scheinbar inhomogener Verteilungen durch Injektion unterschiedlicher Gesamtmengen an Proteinen – die Verteilung variiert mit dynamischem Gleichgewicht, aber nicht mit einer festen Verteilung oder einer falschen Banderweiterungskorrektur.

Aufgrund der oben beschriebenen Einschränkungen ist SEC-MALS nicht für verschiedene Aufgaben geeignet. Es ist nicht für die Analyse von Rohproben geeignet; die Proben sollten durch Standardaffinität und Polierverfahren gut gereinigt werden. Es verfügt nicht über ausreichende Genauigkeit oder Auflösungskraft, um Mutanten und Varianten eines Proteins oder mAb mit der gleichen oder sehr nahen Masse zu identifizieren, und kann nicht mit Analyten verwendet werden, die sich nicht von einer SEC-Säule trennen oder sich von ihr trennen, obwohl kürzlich gezeigt wurde, dass Ionen-Exchang E- oder Reverse-Phase-Chromatographie kann mit MALS kombiniert werden, um Arten zu trennen und zu charakterisieren, die nicht durch SEC⁷²^,⁷³^,⁷⁴aufgelöst werden. Sind die Proteinmengen stark eingeschränkt, ist SEC-MALS möglicherweise nicht durchführbar, da es in der Regel 10 – 200 g³ erfordert und sogar noch mehr von einem FPLC-System mit einem Rohrinnendurchmesser von mehr als 0,25 mm benötigt werden kann; kleinere Mengen können jedoch mit UHPLC-SEC-MALS analysiert werden. Hochinstabile Proteine, die sich bei der Einführung in die mobile Phase aggregieren, sind für die SEC-MALS-Analyse nicht geeignet, obwohl die Pufferoptimierung mit der dynamischen Lichtstreuung außerhalb der Linie dieses Problem überwinden kann⁷⁵.

Trotz des zusätzlichen Aufwands, den SEC-MALS mit sich bringt, ist es für die Proteinforschung von unschätzbarem Wert und wird von der akademischen und biopharmazeutischen Gemeinschaft ausgiebig genutzt. Neben der Charakterisierung von Monomeren, Oligomeren und Aggregaten, wie im obigen Protokoll beschrieben, kann SEC-MALS modifizierte Proteine wie Glykoproteine (die DIE MW des Proteins und der Glykankomponenten individuell bestimmen), Tensid- oder lipidlösliche Membranproteine (Bestimmung der MW der Protein- und Löserkomponenten individuell), Proteinbaugruppen wie virusähnliche Partikel, Protein-Protein- und Protein-Nukleinsäure-Komplexe, Polysaccharide, Protein-Polysaccharid-Konjugate, Peptide und viele andere Biomakromoleküle.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. Tsafi Danieli (Wolfson Centre for Applied Structural Biology, Hebrew University) für die Beratung und Zusammenarbeit. Wir danken auch Daniel Biotech Ltd. (Rehovot, Israel) für die Unterstützung und Etablierung des analytischen FPLC-MALS-Systems, das in dieser Studie verwendet wird.

Materials

AKTA pure	GE Healthcare	29-0182-26	fast protein liquid chromatograph (FPLC)
AKTA UNICORN	GE Healthcare		FPLC control software
ASTRA	Wyatt Technology		MALS data acquisition and analysis software
Bovine serum albumine (purity >97%)	Sigma	A1900	analyte
DAWN or miniDAWN	Wyatt Technology	WH2 or WTREOS	multi-angle light scattering (MALS) detector
Increase 200 10/300	GE Healthcare		size exclusion column, 200 Å pores, 10 mm i.d., 300 mm length
Optilab	Wyatt Technology	WTREX	differential refractive index (RI) detector
Sodium chloride NaCl	Sigma	71382	HPLC grade NaCl
Stericup bottle top filter polyether sulfone 0.1 µm 1000 mL	Millipore	SCVPU11RE	mobile phase filter
Whatman Anotop 10 syringe filter 0.02 µm	GE Healthcare	6809-1002	sample filter
Whatman Anotop 10 syringe-tip filter, 0.1 µm pore, 10 mm diameter	GE Healthcare	6809-1012	sample filter
Whatman Anotop 25 syringe filter 0.1 µm	GE Healthcare	6809-2012	mobile phase filter
WyattQELS	Wyatt Technology	WIQ	dynamic light scattering detector

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Some, D., Amartely, H., Tsadok, A., Lebendiker, M. Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS). J. Vis. Exp. (148), e59615, doi:10.3791/59615 (2019).

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